河北省肾综合征出血热主要流行区汉坦病毒的基因变异研究
目的:了解河北省肾综合征出血热(HFRS)主要流行区疫情变化特征，研究该地区宿主动物所携带汉坦病毒(HV)基因型别和随时间基因变异情况，指导对本病的预防和控制。 方法: 1、收集1996-2013年河北省HFRS主要流行区疫情资料，总结HFRS主要流行区宿主动物的密度、带毒率和鼠种构成等流行病学资料变化特征。 2、夹夜法捕鼠，无菌取鼠肺，用冷冻切片机切鼠肺，冷丙酮固定，间接免疫荧光法(IFA)筛选HV阳性鼠肺。 3、从阳性鼠肺和保存毒株中提取总RNA，应用荧光定量PCR进行基因分型。 4、RT-PCR法扩增G1、G2部分片段及全M基因片段，全M基因片段的产物纯化后经TA克隆连接入pMD19-T质粒载体，转化入DH5α菌。 5、筛选阳性重组质粒，提取后测序，用DNAStar软件进行序列拼接后，用分子进化方法和软件分析病毒核苷酸和氨基酸的同源性，并构建系统发生树，对河北省主要流行区鼠携带HV的核苷酸变异及特征进行分析。 6、应用软件进行数据处理和统计分析。 结果: 1、河北省东北部唐山和秦皇岛市自2001年以来，HFRS发病率明显高于河北省其他地市，2008年两地市HFRS病例大幅攀升，于2013年达河北省HFRS病例总数的90％，目前是我省HFRS的主要流行区。 2、唐山市和秦皇岛市2004-2013年平均鼠密度为2.26％，其中居民区为2.75％，野外为1.16％，二者有逐年上升的趋势。两地市平均鼠带毒率为10.29％，其中居民区为11.23％，野外为2.96％。居民区与野外鼠密度、带毒率总体均有显著性差异。 唐山和秦皇岛市2009-2013年鼠类种群构成经分类鉴定，居民区和野外的主要优势鼠种都是褐家鼠，但居民区与野外的鼠种构成具有显著性差异。 3、对河北省HFRS主要流行区IFA阳性鼠肺及毒株采用实时荧光定量PCR进行分型扩增，结果显示21份阳性标本所携带HV均为SEO型，未发现HTN型。 4、选择研究需要有代表性标本扩增G1、G2基因片段并测序，共获得13个G1片段和14个G2片段序列。HV G1(217-573nt)基因核苷酸同源性为95.5％-100％，其中93HBQ3、93HBQ4和HBQ17/2012比较分别为95.5％、95.8％，TS-2/2004和HBQ20/2007比较为100％，HBT49/2013和HBT50/2013比较也为100％。与R22株进行比较，同源性较高，为94.5％-96.3％，与76-118株的同源性较低，仅为69.9％-71.8％。HV G2(2002-2301nt)基因核苷酸序列同源性比较结果表明，同源性高达97.4％-100％，其中93HBQ3、93HBQ4和HBQ5/2012的同源性均为97.4％，HBQ7/2013和HBQ17/2012的同源性为100％，以及TS-2/2004、HBQ20/2007和HBQ43/2009比较同源性均为100％。与R22株和76-118株的同源性比较分别为90.8％-92.7％和71.3％-72.6％。可见同型之间M片段的基因序列相对比较保守，提示HV没有发生较大的基因变异。 5、根据G1(217-573nt)和G2(2002-2301nt)片段用DNAStar软件包构建系统进化树。G1片段进化树显示QHD-1/2004、TS-2/2004、HBT-3/2012、HBT14/2012、HBT49/2013、HBT50/2013、HBQ20/2007、HBQ43/2009、HBQ5/2012、HBQ17/2012、HBQ7/2013株与BjHD01株在同一支，亲缘关系较近，93HBQ3、93HBQ4和ZT71、changchun株在同一分支，亲缘关系较近，均属于SEO型病毒的S3亚型。G2片段系统进化树显示，93HBQ3、93HBQ4和ZT71、ZT10株在同一分支，亲缘关系较近，TS-2/2004、HBT67/2011、HBT69/2011、HBT-3/2012、HBT14/2012、HBT49/2013、HBT50/2013、HBQ20/2007、HBQ43/2009、HBQ5/2012、HBQ17/2012、HBQ7/2013株与cp27c株在同一支，亲缘关系较近。14份标本均在同一大的分支，即SEO型病毒的S3亚型。结果显示虽同在S3亚型，但93HBQ3、93HBQ4与其它株系统提示已发生明显变化。 6、建立了从鼠肺直接扩增全M基因片段的方法，成功构建了M基因片段的重组质粒。经测序共获得11个M片段全序列，结果显示M基因片段全长3651nt，由5'非编码区、开放阅读框以及3'非编码区三部分组成。5'和3'非编码区的长度分别为47nt、203nt。只存在一个全长为3402nt的完整开放阅读框，编码1133个氨基酸的病毒蛋白前体。与其他HV一样，M基因片段的RNA其3'和5'末端反向互补，形成锅柄状二级结构。 7、11株病毒标本之间核苷酸同源性为95.8％-99.8％，其中93HBQ3和93HBQ4与其他9株病毒核苷酸同源性为95.8％-97.0％。而93HBQ3和93HBQ4两株病毒之间的同源性为98.7％，其他9株病毒之间核苷酸同源性高达98.6％-99.8％。且11份标本均与SEO型HV的毒株(R22、L99、BjHD01、Z37)核苷酸的同源性较高，在83.6％-99.2％之间，与HTN型(Q32、Lee、76-118)核苷酸同源性较低，仅为70.0％-71.7％。进一步提示HV没有发生较大的基因变异。 8、M片段构建的进化树显示HBT-3/2012、HBT14/2012、HBT49/2013、HBT50/2013、HBQ20/2007、HBQ43/2009、HBQ5/2012、HBQ17/2012、HBQ7/2013株与BjHD01在同一小支，亲缘关系较近，93HBQ3、93HBQ4和Z37、ZT10在同一小支，亲缘关系较近，但11份标本与上述参考毒株均在同一分支，均属于S3亚型，而与76-118、Lee、 Q32亲缘关系较远。G1、G2基因部分片段系统进化树分型结果与M基因全序列分型结果一致。 结论: 1、唐山和秦皇岛市是河北省HFRS的主要流行区，近几年疫情呈上升趋势。褐家鼠是该地区的优势鼠种，并且是HFRS的主要传染源。 2、河北省HFRS主要流行区宿主动物所携带的HV基因型为SEO型，基因亚型为S3亚型。 3、河北省HFRS主要流行区鼠携带HV基因未发生较大变异，同型之间M片段序列相对较保守，但同一亚型内不同病毒株存在明显变异。 4、短期时间内HV的基因变异不大，但长期时间HV基因变异会有显著变化。
肾综合征出血热;汉坦病毒;基因变异;流行区疫情
河北医科大学
硕士
流行病与卫生统计学
李琦
2014
中文
R512.8;R373.9
59
2014-10-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）