K域的亚域介导芥菜开花负调因子SVP与FLC同源和异源蛋白互作
开花是植物从营养生长时期向生殖生长的转换，是植物生命周期中的一个重要发育阶段，它决定了植物能否完成有性繁殖。开花时间的早晚，决定了果实，种子等主要植物产品产量上市时间。因此植物开花的研究对于生产和育种具有重大的经济价值。芥菜作为一种十分重要的十字花科类蔬菜作物，在我国各地都有着一定的种植面积。开花时间除了受光照（如日照强度，长度）、温度等外在环境的影响，还受植物生长状态、发育阶段、遗传因素等内在条件影响。主要有自主途径、春化途径、光周期途径和赤霉素途径四条途径调控芥菜开花。虽然这四条途径都有着各自的下游基因调控网络，但最终都会汇集到开花整合子，完成开花调控。目前已经发现了一些的与植物开花相关的基因，如FLOWERINGLOCUS T(FT), SUPPRESSOR OF CO OVEREXPRESSION1(SOC1),FLOWERINGLOCUS C(FLC)，SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)等，其中FT与SOC1促进开花、FLC与SVP抑制开花。 SVP基因最早在拟南芥中发现，它是从早花型突变体中通过En-1转座子第一个被确认，位于第2条染色体上，具有抑制开花的作用。SVP蛋白属典型的MIKC型蛋白，含有一个保守性较强的MADS域和K域，以及保守性稍弱的I域和C域。本实验室前期研究发现芥菜SVP基因编码的蛋白也为MIKC型MADS域蛋白。FLC是一个关键的开花抑制基因，属于MADS-box基因，其编码的的蛋白质属于MADS-box转录因子。本实验室前期研究证明，芥菜FLC与SVP蛋白相互作用，形成一个二聚复合物，对环境信号进行共同介导，抑制下游开花整合子FT与SOC1的表达，进而抑制植物开花。同时发现，FLC与SVP互作域为K域，但是K域可以分为K1，K2，K3三个亚域究竟是哪个亚域对蛋白互作起决定性作用，目前仍不清楚。故本研究对芥菜FLC与SVP的互作亚域进行了筛选。 1、芥菜FLC与SVP亚域的克隆及酵母载体的构建 本研究以实验室保存的芥菜酵母重组质粒pGADT7-FLC、pGADT7-SVP、pGBKT7-FLC、pGBKT7-SVP序列为参照，设计引物。分别亚克隆了芥菜SVP的全长与7个截短体:BjSVP(MIKC)编码241个氨基酸、BjSVP△1(I)编码57个氨基酸、BjSVP△2(K)编码78个氨基酸、BjSVP△3(IK)编码111个氨基酸、BjSVP△4(IK1L1K2L2编码86个氨基酸、BjSVP△5(IK1L1K2)编码80个氨基酸、BjSVP△6(IK1L1)编码64个氨基酸、BjSVP△7(IK1)编码52个氨基酸;以及FLC全长与5个截短体:BjFLC(MIKC)编码197个氨基酸、BjFLC△1(I)编码57个氨基酸、BjFLC△2(K)编码54个氨基酸、BjFLC△3(IK)编码115个氨基酸、BjFLC△4(IK1K2)编码108个氨基酸、BjFLC△5(IK1)编码78个氨基酸。同时构建各个片段的酵母双杂交重组表达载体，分析由K域亚域介导的FLC与SVP异源、同源蛋白相互作用的亚域。 利用同源重组技术，构建了FLC与SVP各个截短体的酵母表达载体pGBKT7-BjFLC、pGBKT7-BjFLC△1～5、pGBKT7-BjSVP以及pGADT7-BjSVP、pGADT7-BjSVP△1～7、pGADT7-BjFLC。利用醋酸锂转化法将重组酵母质粒转化到感受态酵母中，得到酵母转化子Y2Hgold[pGBKT7-BjFLC]、Y2Hgold[pGBKT7-BjSVP]、Y2Hgold[pGBKT7 BjFLC△1～5]和Y187[pGADT7 BjSVP]、Y187[pGADT7BjFLC]、Y187[pGADT7 BjSVP△1～7]。在毒性检测中，转入pGBKT7重组载体的转化子经SD/-Trp筛选发现各重组质粒对Y2Hgold菌株无毒性，转入pGADT7重组载体的转化子经SD/-Leu筛选发现各重组质粒对Y187菌株无毒性。在自激活检测中，转入pGBKT7重组载体的转化子经SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-Gal、SD/-Leu/-Trp(DDO)、SD/-Trp/X-a-Gal/AbA培养基的逐层筛选发现各转化子在Y2Hgold菌株中不存在自激活现象;转入pGADT7重组载体的转化子经SD/-Leu、SD/-Leu/X-a-Gal、SD/-Leu/-Trp(DDO)、SD/-Leu/X-a-Gal/AbA培养基的逐层筛选发现各转化子在Y187菌株中不存在自激活现象。 2、K域亚域介导的FLC与SVP异源蛋白相互作用 Y187[pGADT7-Bj SVP△1～7]分别与Y2Hgold[pGBKT7-BjSVP]转化菌落两两组合，融合酵母中Y187[pGADT7-BjSVP△2～7]×Y2HGold[pGBKT7-BjFLC]、Y187[pGADT7-BjSVP]×Y2HGold[pGBKT7-BjFLC]在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA（QDO/X-α-Gal/AbA）平板上可以长出蓝色菌落。由此推测在FLC与SVP的异源蛋白相互作用中，BjSVP蛋白K域的K1亚域是该相互作用的结合域。β-半乳糖苷酶活性检测和方差分析表明:在异源蛋白相互作用过程中，BjSVP K蛋白中的K2亚域可以加强蛋白的相互作用，K3亚域和L1连接区对蛋白互作强度没有影响，L2连接区对蛋白的相互作用具有削弱作用。 Y2HGold[pGBKT7-BjFLC△1～5]分别与Y187[pGADT7-BjSVP△7]两两融合，融合菌Y2HGold[pGBKT7-BjFLC]×Y187[pGADT7-BjSVP△7]、Y2HGold[pGBKT7-BjFLC△2～5]×Y187[pGADT7-BjSVP△7]可以在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA(QDO/X-α-Gal/AbA)平板上长出蓝色菌落。由此推测在BjFLC蛋白中K域的K1亚域是该相互作用的结合域。β-半乳糖苷酶活性检测和方差分析表明:在异源蛋白相互作用过程中FLC蛋白K域中的K2亚域可增加作用强度，而K3亚域可减弱蛋白作用强度。 3、K域亚域介导的SVP与FLC同源蛋白相互作用 在SVP与SVP同源蛋白互作域筛选实验中，转化子Y187[pGADT7-BjSVP△1～7]与转化子Y2Hgold[pGBKT7-BjSVP]分别两两融合，融合菌V187[pGADT7-BjSVP△2]×Y2HGold[pGBKT7-BjSVP]、Y187[pGADT7-Bj SVP△3]×Y2HGold[pGBKT7-BjSVP]可以在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA(QDO/X-α-Gal/AbA)平板上长出蓝色菌落。因此推测SVP同源蛋白相互作用中完整的K域(K1L1K2L2K3)是BjSVP自身互作所必须的，K域亚域的缺失会破坏自身蛋白的互作。 在FLC与FLC同源蛋白互作域筛选试验中，转化子Y2Hgold[pGBKT7-BjFLC△1～5]与转化子Y187[pGADT7-FLC]两两融合，融合菌Y2Hgold[pGBKT7-FLC△2～5]×Y187[pGADT7-FLC]均可在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA(QDO/X-α-Gal/AbA)平板上长出蓝色菌落。由此推测FLC同源蛋白相互作用中，BjFLC的K域、IK域、IK1K2、IK1均可与BjFLC蛋白自身相互作用，K1亚域是BjFLC同源互作的关键区域。β-半乳糖苷酶活性检测和方差分析检测:在BjFLC蛋白同源相互作用过程中，K2、K3亚域会削弱同源蛋白作用强度。
芥菜;FLC蛋白;SVP基因;K域亚域;酵母双杂交;同源重组技术;开花负调因子
西南大学
硕士
蔬菜学
汤青林
2014
中文
S637;S603.2
75
2014-10-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）