果糖缬氨酸氧化酶的重组表达及其应用
人体血液中的糖化血红蛋白（简称HbA1c）近些年来被用作糖尿病早期诊断和预防的重要指标，它能够反映出一段时期内生物体内的血糖水平。果糖缬氨酸氧化酶(Fructose Valine Oxidase，简称FVO)能催化糖化蛋白质或者糖化氨基酸的氧化分解，产生过氧化氢，氨基酸等成分，因此可以采用此酶通过比色定量法来实现糖化血红蛋白含量的酶法检测，从而广泛应用于糖尿病早期诊断及预防。 本文通过人工合成方式，获得果糖缬氨酸氧化酶基因FVO，对其分别进行了真核和原核表达。 在真核表达中，构建了真核表达载体Bacmid-pFastBac1-FVO，利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，在昆虫细胞Sf9中进行同源重组及目的蛋白的表达，通过Western Blot检测，得到一条约43kDa的条带，证明成功表达。 在原核表达中，构建了原核表达载体pET-15b-FVO，测序正确后，诱导重组菌表达，优化表达条件，得到最佳诱导温度16℃，最佳培养基pH6.0，最佳诱导剂浓度0.8mM，最佳诱导时间24h，最佳转接量1∶20，最佳菌体OD值1.0，最佳诱导转速180rpm。利用His-Binding-resin纯化柱对可溶性目的蛋白进行纯化，每升发酵液可纯化得到8毫克的可溶性果糖缬氨酸氧化酶，纯度大于85％。 对纯化后的样品进行了酶活测定，其比活为2U/mg，最适酶活性条件为30℃-37℃，最佳pH值为6.0-7.0。
果糖缬氨酸氧化酶;杆状病毒表达系统;Sf9细胞;同源重组;糖化血红蛋白;酶法检测
长春理工大学
硕士
生物医学工程
于源华
2014
中文
R587.1;R446.112
87
2014-09-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）