遗传性无虹膜致病基因的定位筛查、RNAi介导的PAX6沉默对B3细胞影响的研究
目的: 中国山东、河南遗传性无虹膜两家系致病基因的定位及突变筛查;构建基因PAX6 RNAi载体;探讨基因PAX6沉默对B3细胞的影响。 方法: 1、致病基因筛查定位。 (1)、分别采集山东遗传性无虹膜合并先天性白内障家系、河南遗传性无虹膜家系的临床资料及血液标本，进行经典遗传学分析和细胞遗传学检查。 (2)、提取家系成员的基因组DNA，采用定位克隆的策略，对山东家系进行全基因组微卫星标记的扫描，经多重PCR反应，Genescan分析基因型，数据文件在Linkage5.2软件上运算，连锁分析计算Lod Score，单倍体分析，精确定位。对河南家系则在已有研究结果上直接进行该区域定位排查，并进一步精细定位。 (3)、从NCBI(National Center for biotechnology Information)等数据库中搜寻定位区域内的候选致病基因的基因序列，设计引物，PCR扩增测序，进行突变筛查。 2、PAX6 RNAi载体构建。 (1)、选择4个PAX6基因RNA干扰靶序列，设计与之对应的shRNA序列，构建并验证shRNA重组质粒载体，构建过表达外源PAX6融合蛋白的293T细胞模型。用shRNA质粒载体进行外源靶序列筛选。 (2)、构建shRNA慢病毒载体，用shRNA慢病毒载体进行内源目标序列筛选，与外源筛选结果共同确定有效的PAX6 RNAi靶序列。 3、应用有效的shRNA干扰慢病毒感染B3细胞，观察PAX6基因干扰后对B3细胞的影响。 结果: 1、致病基因筛查定位。 (1)、根据经典遗传学分析，两家系为常染色体显性遗传，细胞遗传学检查未发现染色体异常。 (2)、定位克隆把山东家系致病基因定位于微卫星Markers D11S915和D11S4101之间，河南家系致病基因定位于微卫星Markers D11S1755和D11S935之间。 (3)、对候选基因PAX6进行PCR双向测序，发现山东家系中PAX6基因的第二个内含子的倒数第二个碱基腺嘌呤A发生缺失突变，导致可能的mRNA拼接错误，而河南家系中未发现PAX6基因突变。 2、PAX6 RNAi载体构建。 (1)、针对候选的4个PAX6干扰靶点，成功构建了PAX6 shRNA的重组质粒载体及表达FLAG tag、PAX6、红色荧光蛋白的融合蛋白表达系统，并在293T细胞上构建了PAX6过表达模型。外源筛靶结果验证了1＃、2＃和4＃靶序列是有效的干扰靶位点。 (2)、成功构建了PAX6 shRNA重组慢病毒载体，在表达内源PAX6的晶状体上皮细胞系B3中进行靶点筛选，其结果与外源筛选结果一致，1＃、2＃和4＃shRNA重组慢病毒对PAX6基因均有明显的干扰效果。 3、PAX6沉默的B3细胞，凋亡细胞数目异常增加。 结论: 1、山东家系的PAX6基因在第二个内含子的倒数第二个碱基腺嘌呤A发生缺失突变(IVS2-2delA)，导致该家系出现先天性无虹膜及先天性白内障表型。 2、河南无虹膜家系的致病基因位点定位在Markers D11S1755和D11S935之间。 3、找到了3个PAX6 RNAi的有效靶序列。 4、建立了PAX6 RNAi质粒载体及慢病毒载体。 5、PAX6基因沉默引起B3细胞过度凋亡。
遗传性无虹膜致病基因;突变筛查;B3细胞;RNAi载体;PAX6沉默;定位克隆
天津医科大学
博士
临床医学;眼科学
孙慧敏
2007
中文
R773.1
134
2014-09-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）