牛肉风味强化肽在酿酒酵母中的克隆和表达
牛肉风味强化肽（BeefyMeatyPeptide，BMP）最初是从牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分离得到的一种八肽。经研究分析证明，BMP与食盐、味精有较好的协同呈味作用，能增强牛肉风味，并且具有良好的热稳定性，可以满足食品工业生产的热处理要求。因此BMP有潜力成为新一代风味强化剂。本课题在实验室已构建的BMP组成型表达载体pGAP9-16BMP，并在毕赤酵母PichiapastorisGS115(pGAP9-16BMP)中成功表达BMP基础上，采用基因工程方法在酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）中组成型表达BMP，利用酿酒酵母代替毕赤酵母作为宿主菌，以食品级菌株作为宿主菌，保证了表达产物的安全性。 以工程菌PichiapastorisGS115（pGAP9-16BMP）基因组DNA为模板PCR扩增PGAP-16BMP，以Scerevisiae基因组为模板PCR扩增终止子CYC1，并将扩增得到的产物克隆于YEp352质粒上，构建成组成型表达载体YEp352-16BMP。将质粒YEp352-16BMP经醋酸锂法转化到S.cerevisiaeW303-1A中，最终通过尿嘧啶营养缺陷型平板筛选和进一步的PCR验证，得到能够分泌表达16BMP的酿酒酵母工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)。 优化工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)摇瓶发酵培养条件。通过单因素实验，找出影响作用较大的三个因素为葡萄糖、YP浓度和培养基初始pH值。通过正交试验选择出了最佳的摇瓶发酵条件水平组合:即葡萄糖浓度为3％(w/v)，YP浓度为1.5×，初始pH为5.0。经过优化后，30℃发酵48h时，BMP在摇瓶水平获得最高表达量可达190mg/L。 在5L发酵罐中进行了分批发酵和补料分批发酵优化酿酒酵母工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)组成型表达BMP。分批发酵时，发酵液中BMP在36h时获得最大表达量为180mg/L。补料分批发酵时，采用分别在发酵至12h、15h、18h、21h、24h时恒速流加8g/L葡萄糖溶液，总糖质量浓度为70g/L的补料策略，在发酵48h时，菌体数目比分批发酵时提高了近一倍，BMP在36h时获得最高表达量为253mg/L。 发酵液经过煮沸，离心取上清，先通过截留分子量为60kDa的中空纤维进行初步纯化，经截留分子量为6000Da的中空纤维进行浓缩纯化，最后将3.5L发酵上清液浓缩为350mL。初步分离纯化得到了16拷贝的BMP目的产物。
牛肉风味强化肽;酿酒酵母;GAP启动子;组成型表达;基因克隆
天津科技大学
硕士
营养与食品卫生学
王艳萍
2012
中文
TS261.4
71
2014-07-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）