DIXDC1通过PI3K-AKT/AP-1途径促进肺癌侵袭转移
前言： DIXDC1是新近被克隆的与人类Wnt信号通路调节有关的新基因，由于其为斑 马鱼ccd1基因(Coiled-coil-DIX1)在人类的同源异构体，故被命名为DIXDC1。DIXDC1有四种不同的亚型，其中在人类表达的主要亚型是1和2，亚型1代表全长DIXDC1即L-DIXDC1，亚型2是缺失了CH(calponin-homology)环的DIXDC1，即S-DIXDC1，与斑马鱼中的ccd1结构类似。在斑马鱼神经管发育过程中被证实ccd1蛋白通过与Dvls的结合，加强Dvls的激活作用，促进经典Wnt信号通路的活性。但到目前为止，仅有报道指出DIXDC1蛋白在人类结肠癌中有高表达，并发现DIXDC1与beta-catenin蛋白有共定位、对结肠癌细胞的增殖有促进作用，并且发现DIXDC1蛋白在结直肠癌中虽然高表达，其mRNA却低表达。但是，DIXDC1在人类其他肿瘤中的表达情况及意义尚不清楚，其调控肿瘤细胞增殖或侵袭的分子机制等都有待于进一步探讨。 在本研究中，我们用免疫组化和western blot等方法检测了DIXDC1的蛋白在肺癌组织和细胞系中的表达，通过双向调控DIXDC1的表达，采用TOPflash和AP-1报告基因的方法，初步探讨了DIXDC1对肺癌细胞侵袭的影响和可能的作用机制。 材料与方法: 一、组织标本与病人资料 167例非小细胞肺癌组织和35例癌旁正常肺组织蜡块均来自于中国医科大学附属第一医院病理科，所有患者术前均未接受化疗或放射治疗。患者平均年龄60岁。根据WHO2004肺癌组织学分类标准，腺癌94例，鳞癌73例。根据2009年国际抗癌联盟TNM分期标准，Ⅰ期56例，Ⅱ期33例，Ⅲ期73例，Ⅳ期5例。在167例肺癌病例中具有完整随访资料的73例。随访是从手术之日起到随访结束日期或由于复发、转移而死亡之日止。另收集17例新鲜的肺癌组织及相对应的癌旁正常的肺组织，保存在-70℃冰箱内，用于提取蛋白质和RNA。 二、免疫组织化学染色 采用Streptavidin-Peroxidase(SP)免疫组织化学方法进行染色，检测DIXDC1在167例NSCLC标本中的表达及其与各临床病理因素之间的关系，也检测了另73例随访标本中DIXDC1表达与患者预后的关系。DIXDC1阳性结果的判定参考Lu Q等的标准。光镜下计数400个肿瘤细胞，以免疫染色的强度(0=negative，1=weak，2=moderate，3=strong)和免疫染色的阳性细胞数(0=absent，1=1～25％，2=26～50％，3=51～75％，4=≥76％)两项评分相乘得到的分数作为每例标本的最终分数，＜3分为阴性表达，≥3分为阳性表达。 三、细胞培养，质粒构建与转染 人肺腺癌细胞系A549和H1299培养于含10％ FBS的RPMI1640培养基中。将DIXDC1质粒（pcs2-Ccd1A和pcs2-Ccd1B cDNAs）导入DIXDC1表达较低的A549细胞系;选择干扰效果较好的DIXDC1 siRNA序列(5'-CGCCCUUCAUGGUCAAUAUTT-3',5'-AUAUUGACCAUGAAGGGCGTT-3')导入DIXDC1表达较高的H1299细胞系。 四、Western Blotting与RT-qPCR 应用Western Blotting与RT-qPCR检测肺癌及癌旁正常肺组织中DIXDC1的蛋白和mRNA表达情况。 五、报告基因检测 我们在24孔板培养的H1299/A549细胞共转染相关报告基因质粒topflsh/AP-1（0.4ug/孔）和pcs2-ccd1A和pcs2-1B（（0.4ug/孔）质粒，24小时之后提取细胞裂解物进行相关报告基因检测，所有结果(mean±SD)均以pRL-TK报告基因活性为标准，以pcs2空质粒为对照。 六、细胞侵袭能力的测定 为了观察DIXDC1对肺癌细胞生物学行为的影响，我们分别过表达与敲除DIXDC1，以及使用PI3K-AKT抑制剂LY294002和AP-1特异性转录因子抑制物诱骗寡核苷酸（5'-TGTCTGACTCATGTC-3'，5'-ACAGACTGAGTACAG-3'）后，用基质胶侵袭试验测定细胞侵袭能力，同时对MMPs进行蛋白和mR.NA水平检测。 结果: 一、DIXDC1在肺癌组织中高表达并与患者的不良预后相关 DIXDC1在正常支气管上皮细胞和肺泡上皮的胞浆中呈现弱的信号，根据我们的评分标准判定为阴性表达。在肺癌组织中DIXDC1的阳性信号定位于胞浆，其阳性表达率为55％(92/167)，明显高于正常肺组织的表达水平(P＜0.001)。;Ⅲ-Ⅳ期的阳性表达率显著高于Ⅰ-Ⅱ期(P＜0.05);有LN转移的病例阳性表达率也明显高于无LN转移的病例(P＜0.05)。但DIXDC1的阳性表达与患者年龄、性别和分化程度均未见关联性(P＞0.05)。Kaplan-Meier生存分析表明，DIXDC1阳性表达患者的平均生存时间短于阴性表达者(P=0.031)。正常肺组织中DIXDC1的蛋白表达均低于配对的肺癌组织(P＜0.05)，但是mRNA表达却高于配对的肺癌组织。 二、DIXDC1蛋白在在肺癌细胞系中高表达并且促进肺癌的侵袭能力 用Westernblot方法检测了7种肺癌细胞系中DIXDC1的蛋白表达情况，发现DIXDC1蛋白含量在各种肺癌细胞系中均明显高于正常支气管上皮细胞系HBE(P＜0.05)。 在DIXDC1表达相对较低的A549细胞系中分别转染pcs2-ccd1 A(L-DIXDC1)和pcs2-ccd1B(S-DIXDC1)，发现和侵袭对照组相比，转染两种质粒后均能增强细胞的侵袭能力(P＜0.05)，但相对于转移的对照组，转染pcs2-ccd1A(L-DIXDC1)后细胞的转移能力明显强于转染pcs2-ccd1B(S-DIXDC1)(P＜0.05)。 三、DIXDC1既可上调经典的Wnt/β-catenin通路又可激活PI3K-AKT依赖的AP-1活性 在H1299和A549肺癌细胞系中过表达DIXDC1，发现经典Wnt通路报告基因活性TOPflash出现了有意义的上调（P＜0.05），但同时我们发现，转染DIXDC1后转录因子AP-1报告基因的活性也出现了明显的增强(P＜0.05)，预示着DIXDC1对AP-1通路也有激活作用。我们检测了PI3K-AKT通路中的AKT的磷酸化水平，发现转染DIXDC1后磷酸化的AKT水平明显增强（P＜0.05），而转染DIXDC1后加入PI3K-AKT的抑制剂LY294002，磷酸化AKT水平受到明显抑制(P＜0.05)，同时AP-1的活性明显下降(P＜0.05)，TOPflash没有明显的改变，此时transwell检测结果发现细胞的侵袭能力受到明显抑制(P＜0.05)。 四、DIXDC1通过PI3K-AKT/AP-1通路激活MMPs促进肺癌的侵袭能力 我们在H1299细胞系中分别过表达和干扰DIXDC1之后，检测了MMP2，MMP7和MMP9的蛋白和mRNA水平，我们发现当转染pcs2-ccd1A和pcs2-ccd1B质粒后MMP2、MMP9和MMP7均有明显升高，而干扰DIXDC1后MMP2、MMP9和MMP7均有下降(P均＜0.05）。为了验证DIXDC1是否通过PI3K/AKT/AP-1途径影响MMPs的活性，我们分别应用PI3K的抑制剂LY294002和AP-1的特异性转录因子抑制物诱骗寡核苷酸(decoy oligodeoxynucleotide，decoy ODN)处理后，转染DIXDC1质粒，对MMP2，MMP9和MMP7进行检测，发现和对照组相比，PI3K的抑制剂LY294002和AP-1的特异性转录因子抑制物均能抑制转染DIXDC1引起的MMPs的增高(P＜0.05)。 结论: 1、DIXDC1在肺癌组织中高表达并与患者的不良预后相关。 2、DIXDC1通过激活PI3K-AKT/AP-1调节的MMPs促进肿瘤的侵袭和转移。
非小细胞肺癌;病理机制;DIXDC1基因;细胞转移
中国医科大学
博士
基础医学;病理学与病理生理学
王恩华
2013
中文
R734.2;R730.2
47
2014-07-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）