Oct4与KPNA2在非小细胞肺癌中的表达与功能研究
前言： 对人类健康危害极大的恶性肿瘤，近年来肺癌的发病率持续升高，在过去的30年中，肺癌所导致的死亡已跃居恶性肿瘤死因的第一位。由于肺癌的发病机制不清，尚不能有效地预防其发生，因此探索肺癌发生的相关机制，寻找特异性的阻断和治疗方法一直是人们努力的方向。 Oct4属于POU转录因子家族，是DNA结合蛋白，通过结合八聚体结构域ATGCAAAT(Oct结构)，活化下游靶基因进行基因调控。主要表达于胚胎干细胞、生殖干细胞以及未分化胚胎癌中，在分化组织内基本无表达，对于维持胚胎干细胞的多潜能性和自我更新具有极其重要的作用，被认为是多潜能性的标志。Oct4作为胚胎干细胞的标志物目前已毫无争议，利用单个转录因子Oct4也成功诱导了人iPS细胞，但其能否作为成体干细胞和肿瘤干细胞的标志物还处于争议当中。 在真核细胞中，Oct4转录因子要履行其功能必须由细胞质进入细胞核，其核质转运通过其特异性的氨基酸序列介导，这些特异性的氨基酸序列称为核定位信号(nuclear localization singals，NLSs)。NLS介导的核转运过程需要像importin-α，importin-β之类的核转运蛋白的参与。尽管核蛋白转运的基本原则已经建立，但对核转运蛋白在分化和发育等生物现象中的作用依然了解很少。目前有研究显示肿瘤形成和肿瘤演进与核质输入和输出受体的核转运机制功能障碍相关。 Importin-α是一个经典的NLS受体。哺乳动物细胞拥有多种importin-α基因，分别在不同的组织中表达，对细胞进程中的组织特异性调控有一定的作用。Yasuhara等研究显示，KPNA2(importin-α1)表达在未分化的胚胎干细胞中，在胚胎干细胞的分化中KPNA2的表达迅速减少。目前已发现KPNA2在乳腺癌、食管癌、前列腺癌中高表达，与细胞增殖和肿瘤形成相关，其重要性受到越来越多的关注。 因此，非小细胞肺癌中Oct4和KPNA2是否表达，其表达是否与肺癌患者的临床病理因素相关，Oct4是否通过KPNA2核定位发挥其功能，Oct4对维持肺癌干细胞的特性是否起到作用等问题都有待于进一步研究。 材料和方法： 1、组织来源: 具有完整随访资料的102例原发性非小细胞肺癌及相应正常肺组织标本均来自2004年到2007年在中国医科大学附属第一医院实行手术的病人，组织经10％中性福尔马林固定、石蜡包埋。患者手术前均未接受放化疗。组织学分类和分化程度根据2004WHO分类标准进行判定，按国际抗癌联盟的肺癌p-TNM分期标准。 2、免疫组织化学染色 将石蜡组织块切成4μm厚切片，脱蜡，脱水，在PH6柠檬酸钠缓冲液中高温高压修复2分钟。3％H2O2孵育20分钟，5％山羊血清孵育30分钟。抗Oct4或抗KPNA2的单克隆抗体4℃孵育过夜。以PBS代替一抗作为阴性对照。采用SP试剂盒检测抗体结合。DAB显色，苏木素复染细胞核，封片。 3、结果判定 Oct4和KPNA2免疫组化染色定位于细胞核认为是阳性信号。我们根据免疫组化染色强度（0分，无;1分，弱;2分，中度;3分，强）和范围（0分:无;1分:＜25％;2分:25％-50％;3分:51％-75％;4分:＞75％）评分之和确定总分数。分数范围是0-7分。根据分数分为阴性:＜4分;阳性:4-7分。 4、细胞培养 肺癌细胞系A549，SPC，1299，LTE，H460，LK2均用含10％热灭活新鲜小牛血清的RPMI1640(Gibco，USA)、100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素的培养基，在37℃、5％CO2的条件下培养。 5、siRNA干扰 人工合成的K，NA2-siRNA、Oct4-siRNA和NCsiRNA阴性对照均购自GenePharma。转染前24小时将细胞按50％密度接种于24孔板，采用HiPerfect转染试剂进行转染，转染后72小时Western blot检测干扰效率。 6、Western Blot法检测蛋白 收集细胞加入裂解液充分裂解，低温高速离心(4℃，12000转/min，30min)，提取上清为总蛋白。上样蛋白量为60ug。电泳（12％SDS-PAGE凝胶）、转印(70V，120min)、5％正常小牛血清封闭，一抗4℃孵育过夜，分别与对应的二抗室温孵育2h，ECL显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪(Chemi Imager5500，AlphaInnotech，USA)采集，进行灰度值测定。 7、Real-time RT-PCR 对于培养细胞采用RNeasy plus Nini kit from(Qiagen)提取总RNA。采用ABIhigh capacity Cdna RT kit(Applied Biosystems)进行反转录。PCR采用SYBR Green染料法，使用ABI7900实时定量PCR仪，按照相应程序进行反应。为了证明扩增产物的特异性引物都进行了融解曲线分析。Beta-actin作为内参，采用相对定量法进行结果分析，△Ct=Ct gene-Ct reference，基因的相对表达量由2-△△Ct计算。实验都重复三次，取平均值。 8、MTT法检测细胞增殖及集落形成 将单个细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔体积200ul含103个细胞，培养24hr,每孔加入MTT溶液继续培养4hr，吸去上清液，加入150ulDMSO(Sigma，USA)，振荡10min,490nm波长下测定各孔光吸收值，以不含细胞的等体积培养基作为对照。绘制细胞生长曲线。 集落形成实验在干扰48小时后接种1000个细胞于6cm培养皿中，2周后用Giemsa染色。 9、免疫共沉淀 收集新鲜培养的细胞中加入裂解液，充分裂解后，每管分别加入100ul磁珠和20ulOct4抗体，使终体积为1ml，4℃孵育30min，用蛋白裂解液冲洗u柱，将蛋白样加入u柱，加入20ul的95℃预热上样缓冲液，孵育5min，用50ul的95℃预热上样缓冲液冲洗，收集液体，做Western blot，重复三次，取平均值。 10、免疫荧光染色 接种细胞于24孔板中，多聚甲醛固定，用0.2％的Triton-X100于常温打孔15-30分钟。1％的BSA常温封闭30分钟。封闭完后加入一抗，4℃过夜。次日，加入相应二抗，室温孵育1个小时后，DAPI染核，荧光显微镜观察。 11、裸鼠致瘤实验 SPC细胞用RPMI1640完全培养液重悬，计数，调整细胞浓度至5×103/ml，接种于BALB/c免疫缺陷小鼠，注射后每周观察一次长瘤情况，注射后8周，断颈处死。 12、统计学分析 采用SPSS13.0(SPSS，Chicago，IL，USA)统计分析软件，分别对Oct4、KPNA2的表达和临床病理因素的关系用卡方检验;生存分析采用Kaplan-Meier法，用Log-rank检验判断差异性;其他实验结果采用t检验进行数据分析，用均值±标准差表示，P＜0.05为差异有意义。 结果: 1、Oct4、KPNA2在非小细胞肺癌中过表达 我们采用免疫组化的方法检测了Oct4、KPNA2蛋白在102例肺癌及20例癌旁正常肺组织中的表达情况。在102例非小细胞肺癌中Oct4阳性表达为29例，阳性率为28.4％，KPNA2阳性表达为56例，阳性率为54.9％，阳性信号主要表达于肿瘤细胞的细胞核中。而在正常肺组织中Oct4、KPNA2为阴性表达。 2、Oct4、KPNA2在非小细胞肺癌中与临床病理因素相关 对Oct4、KPNA2表达分别与临床病理因素相关性进行统计分析，我们发现Oct4表达与肺癌的分化(P=0.002)及TNM分期(P=0.003)有显著关系。KPNA2表达与肺癌组织学类型(P=0.001)和分化(P=0.045)相关。分析Oct4、KPNA2与生存时间发现Oct4阳性的患者生存时间明显小于Oct4阴性患者的生存时间，KPNA2阳性的患者生存时间明显小于KPNA2阴性患者的生存时间(P＜0.01)。 3、Oct4和KPNA2在小细胞肺癌中的表达相关 在一些肺癌组织切片中可以观察到Oct4、KPNA2共表达在一些区域，25.5％病例显示Oct4、KPNA2共同阳性，42.2％的病例表现Oct4、KPNA2共阴性。通过交叉分析显示非小细胞肺癌组织中Oct4、KPNA2的表达有显著相关性(P＜0.01)。 4、Oct4、KPNA2促进肺癌细胞的增殖 我们使用Western blot检测了肺癌细胞系中Oct4、KPNA2的蛋白表达，选择了Oct4、KPNA2表达含量都较高的两种细胞系A549和SPC，进行以下的实验。在这两种细胞系中应用siRNA干扰技术观察Oct4、KPNA2改变对肺癌细胞增殖的影响。应用MTT、集落形成实验检测Oct4变化对肺癌细胞增殖的影响，我们发现干扰Oct4能够抑制细胞生长速度。同样应用MTT和集落实验发现干扰KPNA2也能够抑制肺癌细胞的生长。 5、干扰KPNA2表达抑制Oct4核表达 为了检测肺癌细胞中KPNA2是否有助于Oct4的核定位，我们首先应用免疫共沉淀检测了Oct4与KPNA2能够直接作用。干扰KPNA2表达后应用核浆分离抽提试剂盒提取了核蛋白和浆蛋白，Western blot检测发现干扰KPNA2后Oct4核蛋白表达明显减少，real-time PCR检测发现Oct4mRNA表达水平也明显下调。免疫荧光双染发现Oct4和KPNA2在肺癌细胞系A549和SPC中共定位，干扰KPNA2后，Oct4核表达减少。 6、5-FU处理肺癌细胞后Oct4表达增多，致瘤能力增强 为了证明Oct4对维持肿瘤干细胞的干性发挥作用，我们应用5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)处理SPC细胞，MTT检测5-FU对SPC细胞增殖的影响，发现不同浓度的5-FU作用于肺癌SPC-A1细胞后，细胞的生长有不同程度的抑制，这种抑制呈时间依赖性。流式测细胞周期结果提示:S期细胞比例明显减少，G0/G1期细胞比例明显增加。Western blot检测发现Oct4表达明显增多，裸鼠成瘤实验发现5-FU处理后的SPC细胞比未处理的SPC细胞具有高的成瘤性。 结论: 1、Oct4与KPNA2在非小细胞肺癌组织中高表达，Oct4高表达与分化、TNM分期和不良预后相关;KPNA2高表达与组织学类型、分化和预后不良相关。 2、非小细胞肺癌组织中Oct4与KPNA2的表达明显相关。 3、Oct4与KPNA2都能促进肺癌细胞的增殖。 4、肺癌细胞中KPNA2调控Oct4核定位。 5、Oct4在维持肿瘤干细胞的特性中起重要作用。
非小细胞肺癌;病理机制;Oct4转录因子;KPNA2蛋白;细胞增殖
中国医科大学
博士
基础医学;病理学与病理生理学
贾心善
2013
中文
R734.2;R730.2
62
2014-07-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）