抗双向情感障碍药长期作用通过下调TRPC1表达抑制星形胶质细胞Ca2+依赖的谷氨酸释放
前言： 双向情感障碍(Bipolar disorder，BPD)是一种严重的精神系统疾病，全球发病率约为2-5％。以疾病的躁狂期和抑郁期反复出现为主要特征，患者不仅表现为情绪紊乱，如情感高涨或低落，也伴有相应认知、行为以及生理节律的改变，其发病机制尚不清楚，是一种受遗传和环境影响的疾病。 谷氨酸是神经元和胶质细胞之间信息传递的重要神经递质，是增强神经元突触可塑性和细胞活力的主要因素，目前大量研究证明谷氨酸系统在情感障碍的调解中起重要作用，已成为BPD发病及药物治疗研究的新热点。谷氨酸不仅在脑的发育、神经元的分化迁移、轴突形成中起重要作用，还参与调节脑的高级功能，如突触可塑性、学习、记忆、认知等，对BPD死亡患者脑组织研究发现谷氨酸表达异常增高，应用MRI检测结果也显示BPD患者躁狂期脑内谷氨酸系统活性增高，此外一些研究资料显示应用作用于谷氨酸系统的药物如利鲁唑、氯胺酮、拉莫三嗪等具有抗BPD作用，因此探明谷氨酸系统在BPD发病中的作用对疾病的治疗具有重要意义。 星形胶质细胞是谷氨酸的摄取、代谢和循环的主要场所，最新的研究认为BPD患者脑内星形胶质细胞功能障碍是引起谷氨酸异常的主要原因。神经元缺乏丙酮酸羧化酶和谷氨酰胺合成酶，自身不能合成谷氨酸和谷氨酰胺，星形胶质细胞的主要功能是合成谷氨酰胺并转运到神经元。突触间隙低浓度的谷氨酸对兴奋性的传递十分重要，星形胶质细胞另一个重要功能就是清除细胞外过多的谷氨酸，将谷氨酸从胞外逆浓度梯度转运至胞内，终止突触部位谷氨酸的兴奋性传递，此外星形胶质细胞本身也可释放谷氨酸，与神经元之间进行信息传递，谷氨酸释放水平发生改变将会严重影响其与神经元之间的这种双向、密切的信息交流，并导致各种疾病状态的产生。在BPD患者脑内已发现谷氨酸表达异常伴随着星形胶质细胞的丢失，虽然脑内星形胶质细胞的异常改变在BPD发病过程中所起的具体作用仍不清楚，但研究资料显示其功能障及引起的谷氨酸代谢改变可能是导致BPD的主要原因，目前已成为BPD病理生理机制研究的一个新热点。 星形胶质细胞可通过多种方式释放谷氨酸，但病理状态下Ca2+依赖的方式是其释放的主要机制，细胞内Ca2+来源主要依赖于细胞外Ca2+通道内流以及胞内Ca2+储池释放这两条途径，研究表明细胞内Ca2+储池释放是引起谷氨酸释放的主要因素。在星形胶质细胞内质网上存在两种功能性的Ca2+储池，IP3敏感性Ca2+储池和Ryanodine敏感性Ca2+储池，内质网Ca2+储池释放后可通过激活细胞膜上瞬时受体电位通道(TRPC)，引起胞外Ca2+内流补充胞内Ca2+损失，已证实TRPC是调节细胞内Ca2+稳态浓度的主要通道。 目前使用的抗BPD药物在临床上均不能取得较好的疗效，特别是在患者抑郁期的治疗，有相当比例的患者即使全疗程服用不同的药物也不能取得疗效，而开发更加有效的治疗药物所面临的主要困难就是对疾病发生的病理基础尚不清楚。可溶性锂盐、丙戊酸钠和卡马西平是目前治疗双相精神障碍的常用药，三种药物化学结构均无相似之处，临床上在BPD的躁狂期能引起较好的疗效，但是这些药物发挥疗效的确切药理机制目前尚未阐明，研究药物潜在的共同作用机制是探寻新的药物治疗策略的有效途径。有研究显示大鼠给予锂盐和丙戊酸钠慢性处理两周能明显降低脑内谷氨酸含量，卡马西平慢性作用也能降低高K+诱导的大鼠海马神经末梢谷氨酸的释放，我们实验室之前的研究证明三种药物长期作用可引起星形胶质细胞碱化，抑制细胞对肌醇的摄取，也能上调细胞cPLA2表达，下调细胞谷氨酸受体GluK2亚型的表达，提示三种药物可能对星形胶质细胞内Ca2+及Ca2+依赖的谷氨酸释放具有调节作用，本课题采用原代培养星形胶质细胞方法，观察锂盐、丙戊酸钠和卡马西平长期作用对细胞外高K+刺激诱发的谷氨酸释放的抑制作用并探讨其作用机制，为BPD的药物治疗提供理论依据。 方法： 取新生小鼠大脑皮质进行星形胶质细胞原代培养，加入双丁酰环腺苷酸(dBcAMP)作用1周促进细胞分化成熟。分别加入用碳酸锂(Li2CO3)、丙戊酸钠(VPA)、卡马西平(CBZ)长期作用细胞2周，进行如下实验:①用高效液相色谱法检测细胞外高K+刺激引起的谷氨酸释放量。②细胞用荧光探针染料Fura-2负载，奥林巴斯活细胞荧光显微镜下检测三种抗抑郁药慢性作用对细胞内Ca2+储存释放功能的影响。③RT-PCR法检检测三种抗抑郁药长期处理对细胞TRPC1mRNA表达的影响。 实验结果采用使用SPSS12.0软件进行统计学分析，多组资料用one-wayANOVA方法进行比较，P＜0.05表示差异具有统计学意义。 结果： 1、三种抗BPD药物长期作用2周对星形胶质细胞谷氨酸释放的抑制作用 培养成熟的星形胶质细胞在应用PBS缓冲液刺激时只释放基础量的谷氨酸，当换成45 mM高K+缓冲液刺激后，能促发2-5倍谷氨酸释放的增加，当再次应用PBS缓冲液刺激后，谷氨酸释放量又回复基础释放量。成熟的星形胶质细胞应用Li2CO3(0.25、0.5、1 mM)、CBZ(25μM、50μM)和VPA(100μM、1mM)作用2周对谷氨酸基础释放量没有影响，但不同浓度的三种药物均可明显抑制高K+缓冲液引起的谷氨酸释放量的增加，表现为与对照组细胞相比，第6、7、8、9、10 min谷氨酸释放量明显减少，具有统计学差异。 2、细胞外高K+刺激可通过外Ca2+内流和内Ca2+释放引起星形胶质细胞内Ca2+浓度的增加 培养于盖玻片上成熟的星形胶质细胞用Fura-2处理后进行细胞内Ca2+测定，用340 nm与380 nm的荧光比值(F340/F380)表示细胞内Ca2+浓度。结果显示细胞应用45mMK+刺激能持久引起细胞内Ca2+浓度的增加，分别应用L-型电压依赖钙通道抑制剂Nifedipine和RyR抑制剂Ryanodine后均可抑制45mMK引起的细胞内Ca2+的增加，细胞膜Na+-Ca2+交换抑制剂KB-R7943对45mMK+刺激引起细胞内Ca2+的增加无影响。 3、三种抗BPD药物长期作用可抑制45 mM K引起的细胞内Ca2+浓度升高的水平和持续时间 细胞应用45mMK刺激能持久引起细胞内Ca2+浓度的增加，应用Li2CO3、CBZ、VPA作用2周后的星形胶质细胞给予45 mM K+刺激后，细胞内Ca2+增加幅度降低，且很快恢复正常，表现为高K+刺激后第3、5、7、9、11 min的荧光比值较对照组细胞各时间点明显降低，具有统计学差异。 4、三种抗双相BPD药物长期作用可抑制Adenophostin A(AdA)引起的细胞内Ca2+浓度的增加 AdA是IP3R的激动剂，IP3R是IP3依赖的Ca2+通道，激动IP3R能引起细胞内质网储存Ca2+的释放。应用Li2CO3、CBZ和VPA作用2周后能明显抑制AdA刺激引起的细胞内Ca2+的增加，取激动剂刺激后3个循环的荧光比值结果进行统计分析，与对照组细胞相比，三种药物长期作用组细胞内Ca2+增加幅度明显降低。 5、三种抗双相BPD药物长期作用可抑制4-Chloro-M-Cresol(4-CMC)引起的细胞内Ca2+浓度的增加 4-CMC是RyR的激动剂，RyR是Ca2+依赖的Ca2+通道，激动RyR能引起细胞内质网储存Ca2+的释放。应用Li2CO3、CBZ、VPA作用2周后能明显抑制4-CMC刺激引起的细胞内Ca2+的增加，取激动剂刺激后5个循环的荧光比值结果进行统计分析，与对照组细胞相比，三种药物长期作用组细胞内Ca2+增加水平明显降低。 6、三种抗BPD药物长期作用可抑制星形胶质细胞Ca2+再充功能 Thapsigargin是细胞内质网上Ca2+-ATP酶的抑制剂，将细胞加入Thapsigargin作用10 min，耗竭星形胶质细胞内储存的Ca2+，再重新加入CaCl2后，Li2CO3、CBZ、VPA作用2周能明显抑制星形胶质细胞内Ca2+再充功能。取加入CaCl2后的2 min内的荧光比值结果进行统计分析，与对照组细胞相比，三种药物长期作用组细胞内Ca2+增加水平明显降低。 7、三种抗双相BPD药物长期作用可抑制TRPC1 mRNA表达 RT-PCR结果显示星形胶质细胞应用Li2CO3、CBZ、VPA作用2周后TRPC1mRNA表达较对照组细胞明显降低，具有统计学意义。 讨论： 谷氨酸是星形胶质细胞释放的与神经元之间进行双向信息传递的重要兴奋性神经递质，是增强神经元突触可塑性和细胞活力的主要因素，本实验研究结果发现Li+、CBZ、VPA长期作用能抑制高K+引起的星形胶质细胞谷氨酸释放。目前虽然谷氨酸在BPD发病中的机制还不清楚，但一些研究资料预示谷氨酸信号通路在BPD患者躁狂期增强而在抑郁期减弱，如应用MRI检测结果发现BPD患者躁狂期脑内谷氨酸系统活性增高，对BPD死亡患者脑组织进行特异性染色发现谷氨酸活性增高伴随着大脑海马苔状纤维过渡生长，而临床治疗中BPD患者抑郁期采用利鲁唑和氯胺酮可产生较好的疗效，研究表明利鲁唑不仅能增强Na+依赖的谷氨酸摄取，也能引起星形胶质细胞Na+-Ca2+逆向转运，促进Ca2+内流进而引起谷氨酸递质释放，在BPD的抑郁期增加患者脑内谷氨酰胺/谷氨酸的比率，减轻抑郁症状，氯胺酮在半麻醉剂量使用，具有快速抗抑郁作用，研究认为这与增强神经元和星形胶质细胞谷氨酸-谷氨酰胺代谢循环相关。Li+、CBZ、VPA在临床使用中均在BPD的躁狂期具有较好疗效，而在抑郁期治疗效果不如利鲁唑、拉莫三嗪等其他药物，本研究结果与三种药物在BPD临床治疗中所观察到的现象一致，此外临床上也发现长期服用Li+制剂维持治疗时可加重BPD患者抑郁期的症状，这可能也与本实验结果所显示的Li+长期作用对星形胶质细胞谷氨酸释放的抑制有关，因此这些研究提示谷氨酸盐的平衡可能在BPD发病中起到重要作用，寻找调节谷氨酸系统的特效药物可能在BPD治疗中具有重要意义。 星形胶质细胞在病理状态下通过Ca2+依赖的方式释放谷氨酸，研究报道BPD患者躁狂期细胞内Ca2+水平明显高于正常人，而在BPD抑郁期或无症状期患者细胞内Ca2+无明显变化，这与发现的BPD患者躁狂期脑内谷氨酸系统活性增高相一致。本研究发现三种抗BPD药物长期作用能明显抑制细胞外高K+引起的细胞内Ca2+增加。高K+可通过激活电压依赖性Ca2+通道和促进细胞内Ca2+储池释放两种方式增加细胞内Ca2+，但研究表明内质网中储存Ca2+释放是引起谷氨酸释放主要原因，如Hua等用机械刺激激活星形胶质细胞膜上电压依赖性Ca2+通道，进而引起Ca2+依赖的谷氨酸释放，但在应用IP3R和RyR拮抗剂后，机械刺激引起的谷氨酸释放明显被抑制，本实验中在进一步应用IP3R和RyR激动剂后细胞内Ca2+增加也被抑制，这提示细胞内Ca2+储池再充功能可能被抑制，细胞内质网Ca2+释放后TRPC是Ca2+再充的主要通道，在星形胶质细胞胞浆膜上主要表达TRPC1，本实验中应用Ca2+-ATP酶抑制剂Thapsigargin耗竭细胞内储存Ca2+后，在细胞外重新加入2mM CaCl2，也仅能部分引起细胞内Ca2+的增加，同时本实验也发现三种抗BPD药物均能明显下调细胞TRPC1mRNA的表达，这些结果进一步证实抑制Ca2+的再充功能是三种抗BPD抑制细胞内Ca2+的机制之一。此外我们实验室之前的研究显示三种药物长期给药可通过使星形胶质细胞碱化，调节星形胶质细胞对肌醇的摄取，并上调细胞cPLA2表达。抑制星形胶质细胞对肌醇的摄取可减少IP3产生以及引起的细胞内储存Ca2+的释放，cPLA2表达与花生四烯酸的代谢有关，研究表明花生四烯酸以复杂的方式干扰细胞内游离Ca2+浓度。我们之前的研究也显示三种药物长期给药也能下调细胞谷氨酸受体GluK2受亚型的表达。应用GluK2的拮抗剂NS102或将应用siRNA将GluK2基因沉默后均能明显抑制谷氨酸引起的细胞内Ca2+的增加，进一步研究发现GluK2受体与磷脂酶C相关联的，可通过调节IP3表达影响细胞内储存Ca2+的释放。 综上所述，本研究所使用的三种抗双向情感障碍药物可通过抑制肌醇摄取、上调细胞cPLA2表达、下调GluK2及TRPC1表达多个环节抑制星形胶质细胞内Ca2+的增加，进而抑制细胞Ca2+依赖的谷氨酸释放，这可能是药物治疗BPD的潜在作用机制之一。本研究结果从离体水平上为抑制星形胶质细胞谷氨酸释放在抗BPD治疗中的作用提供了一定的理论依据，但星形胶质细胞释放谷氨酸在突触前神经元、突触后神经元和胶质细胞之间进行兴奋性传递是一种复杂的调节作用，应用MRI技术检测也发现谷氨酸-谷氨酰胺在神经元和胶质细胞代谢循环中是一种动态调节过程，因此BPD患者谷氨酸调节功能机制的失常远比观察到的递质改变复杂，因此探明谷氨酸系统在BPD发病中的作用从而开发出更有效的治疗药物还需大量的深入研究。 结论： 1、Li2CO3、VPA和CBZ三种抗双相精神障碍药物长期作用均能抑制高K+引起的星形胶质细胞内Ca2+浓度的增加及谷氨酸释放。 2、Li2CO3、VPA和CBZ三种抗双相情感障碍药物对细胞内Ca2+浓度的调节作用可能与下调TRPC1表达，抑制Ca2+再充功能相关。
双向情感障碍;谷氨酸;星形胶质细胞;药物治疗
中国医科大学
博士
药学;药理学
彭亮
2013
中文
R749.405
76
2014-07-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）