豚鼠离焦性近视眼巩膜Ⅰ型胶原、整合素α2、β1的表达及bFGF对近视形成的抑制作用
目的： 近年来，随着青少年近视眼发病率的不断升高，近视眼的预防和治疗治引起了全世界广泛的关注。动物实验性近视眼模型的建立，为近视眼的研究提供了有效的手段。用凹透镜模拟的视环境的改变可以短期内造成动物眼轴伸长，近视屈光度增加，建立光学离焦性近视眼模型，这种离焦性近视眼模型与人类近视眼的发病更加相似。研究表明，眼轴的伸长是巩膜组织的异常重塑的结果，因此，重视对实验性近视眼巩膜组织的研究，并找到有效的抑制细胞外基质异常重塑的手段，是近视眼防治切实可行的方向。Ⅰ型胶原是巩膜组织的最主要成分，以往对其研究多集中在合成和降解的改变，而另一种和胶原密切相关的基质成分——胶原结合整合素受体的研究少有报道。本实验建立豚鼠离焦性近视眼模型，检测整合素在巩膜的表达及在近视眼是否存在差异，并观察球周注射碱性成纤维细胞生长因子对近视形成的影响，探讨近视眼巩膜重塑的发病机制及防治手段。 方法： 实验一: 建立凹透镜诱导的豚鼠离焦性近视眼模型，观察视环境的改变即离焦与近视形成后的短期恢复对豚鼠屈光状态、眼轴长度的影响，以及巩膜组织形态学改变。 40只3周龄豚鼠，双眼屈光检查无近视状态，无明显屈光参差。随机分组:①光学离焦组:16只，右眼戴-7D镜片，为离焦组实验眼（16眼），戴镜14天;左眼不戴镜，自身对照眼（16眼）。②离焦后恢复组:16只，右眼为实验眼(16眼)，戴镜14天后，去除右眼镜片，自然视环境下饲养2天;左眼为自身对照眼（16眼）。③空白对照组:8只正常豚鼠，共16眼，不做任何处理，和实验组同周龄。 实验开始前双眼滴1％托吡卡胺滴眼液，待睫状肌麻痹后，行带状光检影验光。验光结束后，眼表面麻醉，使用A超仪测量双眼眼轴长度，测量从角膜顶点到眼球后极部玻璃体视网膜界面的距离。 PMMA镜片放于自制黏贴式尼龙扣中，粘贴于离焦组豚鼠右眼眼前。室内地面无限制饲养，光照周期约为14h/10h。14天后戴镜豚鼠右眼去除镜片，再次测量屈光度和眼轴长度，离焦组和空白对照组豚鼠处死，取材。恢复组去除镜片后，自然环境下饲养2天，第三次测量屈光度和眼轴长度，测量结束处死，取材。角膜缘后2mm处分割巩膜，取后部巩膜为检测对象。每组中处理因素相同的眼球，随机抽取2眼用于电镜标本制作，浸泡于2.5％戊二醛中固定;随机抽取2眼用于胶原特殊染色;6眼于眼球专用固定液中固定24小时，用于免疫组化染色;6眼迅速置于液氮罐中，用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的检测。 实验二: 第一部分实验中各组动物于设定实验时间处死，每组随机抽取6份巩膜样本行RT-PCR法检测各实验组后部巩膜中Ⅰ型胶原α1(1)链、整合素α2、β1及ILK的mRNA水平表达，6份用于免疫组化染色，检测整合素α2、β1及ILK在巩膜的定位及蛋白水平的表达。 实验三: 应用球周注射的方法，观察bFGF对豚鼠离焦性近视形成的抑制作用。42只3周龄三色豚鼠，随机分为4组:A:正常对照组，6只，12眼，与各实验组年龄匹配的正常豚鼠。B:光学离焦组，12只，右眼戴-7D镜片。C:光学离焦+PBS组，12只，右眼戴-7D镜片+隔日一次PBS球周注射。D:光学离焦+bFGF组，12只，右眼戴-7D镜片+隔日bFGF球周注射。实验时间为14天。 于实验开始前和结束时睫状肌麻痹后行带状光检影验光，A超仪测量双眼眼轴长度。 将rhbFGF溶于PBS缓冲液中，浓度为100ng/ml。C、D组豚鼠从右眼离焦的当天开始，隔日同一时段，氯胺酮75mg/Kg股部注射轻度麻醉后，分别球周注射bFGF和PBS缓冲液50μl。 实验结束后处死动物，小心剥离后部巩膜，每组随机各取6份用于RT-PCR检测Ⅰ型胶原α1链、整合素α2、整合素β1的mRNA水平表达。6份用于WesternBlot法检测蛋白表达。 统计学分析: 采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析:组间差异用one wayANOVA检验，两两比较采用LSD法检验;左右眼差异应用配对T检验比较。所有数据用((x)±s)表示，P＜0.05为差异有统计学意义。 结果： 实验一: 实验前3周龄豚鼠屈光度约为+3.00D远视，眼轴约7.3mm，各组间、组内双眼间屈光度、眼轴长度差异无统计学意义(P＞0.05）。 用-7D凹透镜经14天光学离焦可以造成豚鼠近视眼。实验眼呈中度近视状态，屈光度为-3.33±0.16D，与组内对照眼、空白对照眼比较，差异有显著性(P＜0.01）。离焦恢复组的实验眼在离焦恢复2天后屈光度为-2.48±0.19D，与恢复当天比较，屈光度减少，差异有显著性(P＜0.01）。 14天后，离焦组和恢复组的实验眼眼轴伸长，与各自对照眼比较，差异有显著性(P＜0.01）。离焦恢复组的实验眼去除镜片后在正常视环境下2天，与去除离焦时(14d)眼轴比较无变化(P＞0.05）。 巩膜形态学观察见离焦性近视眼豚鼠后部巩膜胶原纤维排列紊乱，巩膜变薄。电镜下胶原纤维密度减少，小直径胶原纤维增多，成纤维细胞形态不规则。 苦味酸-天狼猩红胶原染色显示Ⅰ型胶原主要分布于后极部，实验眼Ⅰ型胶原纤维密度减少，排列紊乱。 实验二: 免疫组织化学染色可见，豚鼠巩膜组织可见整合素β1、整合素α2和ILK的蛋白表达，于扁长形或梭形的成纤维细胞胞核周围，不规则的棕黄色着色。整合素β1、整合素α2和ILK在离焦组和恢复组的实验眼巩膜表达均减弱，与对照眼和正常眼比较差异有统计学意义(P＜0.05)。离焦恢复2天整合素β1、整合素α2和ILK蛋白表达较离焦组无差异。 Ⅰ型胶原α1(1)链、整合素β1、整合素α2和ILK在离焦组和恢复组的实验眼的mRNA水平表达下降，与自身对照眼比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)经过2天的恢复，可见整合素Ⅰ型胶原α1(1)链、整合素β1、整合素α2和ILKmRNA水平表达比离焦组实验眼有增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。 实验三: 14天后，光学离焦组、光学离焦+PBS组、光学离焦+bFGF组豚鼠均出现单眼近视，PBS注射组的实验眼屈光度为-3.27±0.16D，眼轴长度为8.00±0.02mm，光学离焦组屈光度为-3.48±0.15D，眼轴长度为8.04±0.03mm，两组比较差异无统计学意义(P＞0.05）。bFGF球周注射组的近视屈光度为-1.46±0.11D，眼轴长度为7.71±0.02mm，和光学离焦组、PBS注射组比较，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。bFGF组的Ⅰ型胶原、整合素α2、整合素β1的mRNA和蛋白水平表达较光学离焦组、PBS注射组增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论： 1、3周龄的豚鼠用-7D的凹透镜离焦14天可成功诱导出实验性轴性近视，实验眼的后极部巩膜变薄，胶原纤维排列紊乱，间隙变大，小直经纤维增多以及成纤维细胞的形态异常，表明实验性近视眼的形成是巩膜异常重塑的过程。 2、离焦诱导近视眼形成后去除镜片、经过2天的恢复，近视度数下降，进一步证实短期视环境改变即可引起屈光度变化，但眼轴长度没有改变，巩膜重塑导致的眼轴伸长短期内不能恢复。 3、豚鼠巩膜Ⅰ型胶原主要分布于后极部，Ⅰ型胶原的改变是近视眼巩膜重塑的重要因素。 4、豚鼠离焦性近视眼巩膜内整合素β1、整合素α2、ILKmRNA和蛋白表达水平下降，参与实验性近视眼巩膜重塑过程。去除离焦恢复2天后，巩膜内整合素β1、整合素α2、ILKmRNA水平表达回升，表明巩膜内整合素β1、整合素α2、ILK是巩膜重塑过程的早期调节因子。 5、外源性bFGF能够上调豚鼠实验性近视眼后部巩膜Ⅰ型胶原、整合素β1、α2表达，抑制豚鼠离焦性近视眼巩膜异常重塑，控制眼轴的伸长。 6、球周注射bFGF可以有效作用于豚鼠后部巩膜，抑制实验性近视眼的形成，证实巩膜是外源性bFGF作用的重要靶点。
离焦性近视眼;发病机制;巩膜组织;Ⅰ型胶原;整合素;碱性成纤维细胞生长因子
中国医科大学
博士
眼科学
徐艳春
2009
中文
R778.110.2
79
2014-07-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）