Survivin shRNA与大黄素联合应用抗卵巢癌治疗实验研究
目的： 在女性生殖系统恶性肿瘤中，卵巢癌(Ovarian cancer, OC)发病率居第二位，死亡率居首位。卵巢癌通常发现时已属晚期，且患者易对化疗药物产生耐药，导致治疗效果不理想，已成为女性生殖系统肿瘤中死亡率最高的恶性肿瘤。随着诊断手段的提高以及治疗方法的进步，卵巢癌患者病情获得一定缓解，但总体预后并不理想，五年生存率仍低于50％，晚期患者不到30％。因此，卵巢癌的治疗是妇科肿瘤学界面临的一个重大难题和严峻挑战，迫切需要寻找特异性强且患者能够耐受的治疗方法。 Survivin是凋亡抑制蛋白（Inhibitor of apoptosis protein, IAP）家族中的一员，它在细胞凋亡和分化中扮演重要角色，具有抑制细胞凋亡和调节细胞增殖的双重功能，对细胞周期起调控作用。研究发现Survivin在成人分化成熟的正常组织中几乎无表达，在胎盘、胸腺组织以及结肠上皮基底部细胞等快速分裂的正常细胞中少量表达，而在腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤等大多数恶性肿瘤组织中高表达。 Survivin在肿瘤细胞中表达特异性强而在正常组织不表达的特点，使它现已成为肿瘤诊断和治疗的理想的靶点，如何靶向Survivin的治疗成为近年来研究的热点。 大黄素(Emodin)是一种蒽醌类物质，是从大黄属、寥属、鼠李属和番泻叶中分离出来的主要有效单体。大黄素在临床上具有多种药理学活性，包括抗菌、抗炎、舒张血管、免疫抑制和抑制溃疡形成等。近年来，大黄素的抗肿瘤作用逐渐成为研究的热点。已有研究发现大黄素能够抑制多种恶性肿瘤细胞的生长并诱导凋亡，其中包括肝癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌和白血病等。 因此，本课题将靶向Survivin基因的肿瘤分子靶向治疗技术与中药治疗相结合，探讨靶向Survivin基因的短发夹RNA(small harpin RNA，shRNA)与大黄素联合应用抗卵巢癌治疗的效果，旨在为抗卵巢癌治疗提供客观、科学的理论基础和实验依据，从而为卵巢癌的临床治疗开辟有效的新途径。 材料和方法： 1.本实验的研究对象为人卵巢癌细胞系SKOV3和HO8910。 2.构建携带靶向Survivin基因的shRNA质粒载体，通过脂质体法将质粒转染到卵巢癌细胞中。转染成功后，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达来检测质粒的转染效率。 3.按实验设计进行分组，通过实时荧光定量PCR(Real time PCR)技术观察Survivin mRNA在不同组别中的表达水平。 4.通过蛋白质印迹法(Western blot)检测Survivin蛋白在不同组别中的表达水平。 5.通过MTT法检测细胞增殖活性，观察Survivin shRNA质粒转染与大黄素对卵巢癌细胞的生长抑制作用。 6.流式细胞仪(Flow cytometry，FCM)检测Survivin shRNA质粒转染与大黄素联合应用对卵巢癌细胞的凋亡诱导作用。 7.使用Transwell小室，通过细胞体外侵袭实验观察Survivin shRNA质粒转染与大黄素联合应用对卵巢癌细胞的侵袭能力的影响。 结果： 1.倒置荧光显微镜下观察Survivin shRNA质粒在SKOV3和HO8910细胞中的转染效率约为60-70％。 2.Real timePCR结果显示，Survivin shRNA质粒转染后SKOV3和HO8910细胞中Survivin mRNA表达水平明显下降，与空白对照组比较差别明显(P＜0.05)。 3.Western blot实验结果显示，Survivin shRNA质粒转染后SKOV3和HO8910细胞中Survivin蛋白表达水平明显下降，与real time PCR结果一致。 4.Survivin shRNA质粒转染能够有效降低卵巢癌细胞的增殖率，与空白对照组比较差别明显(P＜0.05);大黄素对卵巢癌细胞的生长抑制作用呈浓度和时间依赖模式，大黄素60μM组与空白对照组比较差别明显(P＜0.05); Survivin shRNA质粒转染与大黄素联合应用能够进一步抑制卵巢癌细胞的生长，与单药应用组差别显著(P＜0.05)。 5.Survivin shRNA质粒转染能够明显诱导卵巢癌细胞发生凋亡，大黄素60μM同样具有诱导卵巢癌细胞发生凋亡的作用，与空白对照组相比差别显著(P＜0.05); Survivin shRNA质粒转染与大黄素联合应用能够进一步增加卵巢癌细胞的凋亡率，与单药应用组差别显著(P＜0.05)。 6.在细胞侵袭实验中，Transwell结果显示，Survivin shRNA质粒转染与大黄素60μM均能够抑制卵巢癌细胞的侵袭能力，二者联合应用后卵巢癌细胞的侵袭能力明显被抑制，与单药应用组差别显著(P＜0.05)。 结论： 1.Survivin shRNA质粒转染能够抑制卵巢癌细胞生长，诱导卵巢癌细胞凋亡，降低卵巢癌细胞的体外侵袭能力。 2.一定浓度的大黄素对能够抑制卵巢癌生长，诱导卵巢癌细胞发生凋亡，降低卵巢癌细胞的体外侵袭能力。 3.Survivin shRNA质粒转染与大黄素联合应用能够明显增加对卵巢癌细胞的生长抑制作用，增加卵巢癌细胞的凋亡率，抑制细胞侵袭。二者联合应用可能具有协同作用。
卵巢癌;凋亡抑制蛋白;大黄素;疗效评价
中国医科大学
博士
临床医学;肿瘤学
郑新宇
2013
中文
R737.31;R730.5
68
2014-07-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）