PinX1基因在肾癌发生发展中功能及分子机制研究
目的：研究PinX1基因对肾癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，探索其发挥作用的分子生物学机制。 方法：分别用Control-siRNA，PinX1-siRNA，pEGFP-C3质粒，pEGFP-C3-PinX1质粒转染肾癌786-O和ACHN细胞，Western Blot检测PinX1-siRNA和pEGFP-C3-PinX1对两种肾癌细胞中PinX1蛋白表达的影响。Transwell细胞迁移实验观察PinX1基因干涉及过表达对肾癌786-O和ACHN细胞迁移能力的影响。细胞侵袭实验观察PinX1基因干涉及过表达对两种肾癌细胞侵袭能力的影响。CCK-8细胞增殖实验检测PinX1基因干涉及过表达对两种肾癌细胞增殖能力的影响。明胶酶谱实验检测PinX1基因干涉及过表达对两种肾癌细胞分泌MMPs的影响;Western Blot实验观察PinX1基因干涉及过表达对两种肾癌细胞中MMPs及TIMPs蛋白表达的影响。最后，我们在PinX1基因干涉的两种肾癌细胞中加入MMP-2抑制剂阻断MMP-2通路，观察阻断MMP-2通路后干涉PinX1对肾癌细胞迁移和侵袭能力的影响。 结果：1.Western Blot实验显示:与Control-siRNA组相比，转染PinX1-siRNA能降低786-O和ACHN细胞中PinX1基因的表达;而与pEGFP-C3组相比，转染pEGFP-C3-PinX1能上调两种肾癌细胞中PinX1基因的表达;2.Transwell细胞迁移实验显示:转染PinX1-siRNA后穿过Transwell小室的786-O和ACHN细胞的数目较转染Control-siRNA组明显增加，差异有统计学意义(786-O组P＜0.01，ACHN组P＜0.001)，提示PinX1基因干涉能促进肾癌细胞的迁移能力;而转染pEGFP-C3-PinX1后穿过Transwell小室的肾癌细胞数目较转染pEGFP-C3组明显下降，差异有统计学意义(P＜0.01)，提示PinX1基因过表达能抑制剂肾癌细胞的迁移能力。3.细胞侵袭实验显示:转染PinX1-siRNA后穿过Transwell小室的786-O和ACHN细胞的数目较转染Control-siRNA组明显增加，两组比较差异有统计学意义(P＜0.001)，提示干扰PinX1基因能促进肾癌细胞的侵袭能力;而转染pEGFP-C3-PinX1后穿过Transwell小室的肾癌细胞数目较转染pEGFP-C3组明显下降，两组比较差异有统计学意义(P＜0.001)，提示PinX1基因过表达能抑制肾癌细胞的侵袭能力。4.CCK-8细胞增殖实验显示:PinX1基因干涉和过表达对两种肾癌细胞增值能力的影响均不明显，组间差异无统计学意义(P＞0.05)，提示PinX1基因可能不影响肾癌细胞的增殖。5.明胶酶谱实验显示:转染PinX1-siRNA后786-O和ACHN两种肾癌细胞中基质金属蛋白酶MMP-2的酶活性较转染Control-siRNA组明显增加，两组比较差异有统计学意义(P＜0.01);而转染pEGFP-C3-PinX1后两种肾癌细胞中MMP-2的酶活性较pEGFP-C3组显著下降，两组比较差异有统计学意义(P＜0.001);这提示PinX1基因可能通过激活MMP-2促进肾癌细胞的迁移和侵袭。6.Western Blot实验显示:转染PinX1-siRNA后786-O和ACHN细胞中MMP-2的蛋白表达水平比Control-siRNA组显著升高，两组比较差异有统计学意义(P＜0.001);而转染pEGFP-C3-PinX1后两种肾癌细胞中MMP-2的蛋白表达水平较pEGFP-C3组明显下降，两组比较差异有统计学意义(P＜0.001);而PinX1基因干涉和过表达对基质金属蛋白酶特异性内源性抑制剂TIMP-2的表达均无明显影响，组间差异无统计学意义(P＞0.05)，提示PinX1基因干涉可能不是通过下调TIMP-2表达来激活MMP-2通路。7.最后我们在PinX1干涉的两种肾癌细胞中用MMP-2抑制剂阻断MMP-2通路以后，明胶酶谱实验显示:MMP-2的活性降低到了对照组水平;Western Blot实验显示:MMP-2的蛋白表达量降低到了对照组水平;细胞迁移、侵袭实验显示:肾癌细胞的迁移、侵袭能力降低到了对照组水平;这些结果进一步证实PinX1基因干涉通过激活MMP-2通路促进肾癌细胞的迁移和侵袭。 结论：干涉PinX1基因可以上调MMP-2表达，从而激活MMP-2通路，显著提高肾癌细胞的迁移、侵袭能力;而PinX1过表达可以下调MMP-2表达，从而抑制MMP-2通路，降低肾癌细胞的迁移、侵袭能力;因此PinX1基因可能是预测肾癌转移的新的分子标志物，将在肾癌的治疗中发挥重要作用。
肾癌;细胞增殖;分子生物学机制;迁移能力;侵袭能力
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
肿瘤学
郑骏年
2013
中文
R737.11
77
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）