PEDF对大鼠缺血心肌血管再生数量和血管渗透性的影响
目的：本研究通过建立大鼠心肌梗死模型，在梗死心肌局部转染PEDF-RNAi-LV和PEDF-LV，通过干扰表达和过表达色素上皮衍生因子（pigmentepithelial-derived factor，PEDF），探讨PEDF对大鼠梗死心肌血管再生数量和渗透性的影响，并初步探讨相关机制。 方法：成年SD大鼠，结扎冠状动脉左前降支，建立心肌缺血动物模型。构建PEDF-RNAi-LV和PEDF-LV病毒载体，采用心肌分点直接注射方法转染至缺血心肌组织。实验随机分为6组:A组（正常组）:未开胸正常大鼠;B组（siPEDF组）:在心肌缺血局部，转染PEDF-RNAi-LV和Ehanced-Infection-Solution混合液;C组（PEDF过表达组）:在心肌缺血局部，转染PEDF-LV Ehanced-Infection-Solution混合液;D组（载体对照组）:在心肌缺血局部注射同等剂量NC-RNAi-LV和Ehanced-Infection-Solution混合液;E组（溶剂对照组）:在心肌缺血局部注射同等剂量病毒稀释液;F组（单纯梗死组）:单纯行冠状动脉结扎不注射任何试剂。 模型建立4周后，通过检测局部心肌组织PEDF、血管内皮生长因子(vascularendothelial cell growth factor，VEGF)和血管内皮生长因子受体2(vascularendothelial cell growth factor receptor2，VEGFR2)蛋白表达的变化，观察PEDF对它们的影响。采用免疫组织化学染色确定VEGFR2阳性新生血管内皮细胞(tipcell)数量，免疫荧光检测α-SMA阳性血管的数量和Fitc-LectinB4染色，观察PEDF对心肌血管再生数量的影响。通过检测血管渗透性和内皮细胞间连接的主要功能蛋白VE-cadherin、β-catenin和Occludin以及MAP激酶/GSK/β-catenin信号路径相关蛋白，观察PEDF对大鼠缺血心肌血管渗透性的影响，初步探讨相关机制。 结果： 1大鼠心肌梗死模型建立及检测 结扎左冠状动脉前降支后，可见心肌区域颜色由鲜红变为暗紫色。心电图显示，结扎后ST段弓背向上，表明心肌梗死模型建立成功。美蓝注射实验证明试剂可浸润心肌全层，心肌注射方法可用于基因转染。Masson三色染色显示，正常心肌细胞呈红色，梗死区瘢痕胶原纤维呈蓝色。 2病毒转染效率的检测 siPEDF组、PEDF过表达组、载体对照组可检测到大量绿色GFP蛋白表达，正常组、溶剂对照组及单纯梗死组中未检测到绿色GFP蛋白表达。 3心肌梗死组织中血管再生相关蛋白检测 Western blot检测结果显示:与正常组、载体对照组、溶剂对照组及单纯梗死组相比，siPEDF组PEDF蛋白表达降低，VEGF和VEGFR2蛋白表达量显著增多。PEDF过表达组PEDF表达显著升高，VEGF和VEGFR2蛋白表达量显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。 4 PEDF对心肌血管再生数量的影响 免疫组化结果显示，siPEDF组VEGFR2阳性细胞数量较其他各组明显增加(P＜0.05)。PEDF过表达组VEGFR2阳性细胞数量较除正常对照组之外其他各组明显减少(P＜0.05)。siPEDF组Fitc-LectinB4阳性血管数量较除正常对照组之外其他各组均显著增加(P＜0.05)，但是，其血管形态紊乱，PEDF过表达组Fitc-LectinB4阳性的血管数量较其它各组显著减少(P＜0.05)。α-SMA免疫荧光染色各处理组均少于正常对照组，各处理组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。 5 PEDF对心肌血管渗透性的影响 Evans blue心脏血管灌注实验观察可见，正常对照组和PEDF过表达组心脏基本无蓝染，siPEDF组心脏梗死局部蓝染显著。心肌组织匀浆Evans blue含量检测显示，siPEDF组心肌组织匀浆Evans blue含量高于其他各实验组(P＜0.05)，PEDF过表达组较除正常对照组之外其它各组降低(P＜0.05)。Western blot检测结果显示，siPEDF组Occludin蛋白表达量较其它各组显著下降，而PEDF过表达组较除正常对照组之外的其它各组Occludin蛋白表达量显著增多(P＜0.05)。石蜡切片VE-cadherin免疫组织化学染色结果显示， PEDF过表达组、siPEDF组较各对照组，在血管内皮中分布变化不显著。Western blot检测VE-cadherin蛋白表达量在各实验组间差异无统计学意义，但是siPEDF组VE-cadherin的酪氨酸Y731位点磷酸化水平较其它各组显著增高，而PEDF过表达组较除正常对照组之外的其它各组显著降低(P＜0.05)。同时，免疫共沉淀结果也显示，siPEDF组VE-cadherin和β-catenin结合量较其它各组显著减少，而PEDF过表达组较除正常对照组外的其它各组显著增多(P＜0.05)。siPEDF组MAPK家族中p38、ERK1/2和GSK3β磷酸化水平增加，胞质和胞核中β-catenin表达均增加。PEDF过表达组抑制了p38、ERK1/2和下游GSK3β磷酸化，胞质和胞核中β-catenin均显著减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论：在大鼠缺血心肌组织中: 1.PEDF通过影响VEGF和VEGFR2蛋白表达调控血管再生数量，但对已经存在的血管无调节作用。 2.PEDF可影响心肌血管内皮细胞间连接蛋白的表达及生理功能，可能通过MAP激酶/GSK/β-catenin信号路径调控血管的渗透性。
血管再生;血管渗透性;心肌梗死;动物模型;免疫组化
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
外科学(胸心外科)
张中明
2013
中文
R542.22
71
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）