EPCs移植促进兔肝静脉型BCS肝静脉回流作用的实验研究
第一部分 兔骨髓内皮祖细胞的分离、培养和鉴定 目的：研究家兔骨髓内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)的分离、培养方法，对其进行表型和功能鉴定，为后续实验研究做好准备。 方法：健康成年家兔为研究对象，密度梯度离心法分离兔骨髓单个核细胞(MNCs)，将其接种在人纤维连接蛋白(FN)包被的培养板中，采用专用的EGM-2MV完全培养基对MNCs进行诱导分化培养，动态观察细胞生长过程;通过DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)和FITC标记的凝集素UEA-I(FITC-UEA-1)双染法鉴定EPCs，显示红色荧光的为吞噬了Dil-acLDL的细胞，绿色荧光为结合UEA-1的细胞;FITC-CD133和PE-CD34免疫荧光技术对EPCs表面标志物进行表型鉴定。 结果：1.细胞形态表现:新分离的兔骨髓MNCs圆形透亮，24 h后部分细胞贴壁，第4～5 d可见到贴壁短梭型细胞，5～7 d后细胞迅速增殖，细胞集落大量出现，10d细胞开始融合，呈现铺路石样改变。2.EPCs鉴定表现:培养第7d时，贴壁细胞可以内吞DiI-acLDL，同时具有结合FITC-UEA-1的功能;EPCs可同时表达CD34/CD133，结合CD34的EPCs可见红色荧光，结合CD133的EPCs表现为绿色荧光。 结论：从兔骨髓中能成功分离出具有EPCs特征的细胞群体。 第二部分 肝静脉丝线缩窄法制备兔肝静脉型布加综合征模型 目的：探讨肝静脉丝线缩窄法制备兔肝静脉型布加综合征(BCS)模型的可行性、安全性和有效性，为进一步实验研究提供良好的动物模型。 方法：将24只家兔随机分为实验组(n=18)和对照组（n=6）。实验组予靶肝静脉（肝左、中静脉共干支）缩窄术，上腹部正中开口进腹，充分暴露肝脏，向下牵开兔肝显露第二肝门，离断镰状韧带、左三角韧带，分离肝右静脉，切开下腔静脉表面外膜，自肝右静脉内侧缘向左侧分离出靶肝静脉，术中排空靶肝静脉血流并测量其直径，以直径为标准缩窄靶肝静脉;对照组仅行靶肝静脉分离术。对照组术后第2周6只兔、实验组术后第2、4、8周每次随机选出6只兔，均全麻下经CDUS检查肝静脉阻塞情况及肝脏回声变化，测量肝静脉及门静脉血流动力学变化;处死动物，采集靶肝静脉及其引流区内的肝脏组织标本，光镜下观察肝组织结构变化，将实验组各观察点结果与对照组相应结果进行比较。 结果：1.建模成功率100％，两组均无感染、死亡等并发症。2.CDUS示:对照组术后第2周6只兔靶肝静脉均通畅，靶肝静脉引流区肝实质呈均匀等信号，门静脉主干内径、平均流速、血流量分别为(5.10±0.43)mm、(12.30±0.96)cm/s、(150.34±17.88) ml/min。实验组术后第2、4、8周靶肝静脉内膜增厚，管腔狭窄50％，引流区肝实质回声分别呈不均匀等及稍高混杂回声、均匀高回声、不均匀稍高回声。实验组术后第2周门静脉内径、平均流速、血流量分别为(6.47±0.60) mm、(9.32±0.84) cm/s、(182.51±11.68) ml/min，与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);实验组术后第4周门静脉内径、平均流速、血流量分别为(5.50±0.41) mm、(11.80±1.20) cm/s、(160.81±8.94) ml/min，与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05);实验组术后第8周门静脉内径、平均流速、血流量分别为(5.05±0.31) mm、(10.90±0.85) cm/s、(132.12±24.18) ml/min，门静脉平均流速、血流量均低于对照组（P＜0.05），门静脉内径间无统计学差异(P＞0.05)。对照组术后2周门静脉压力为(9.27±0.79) cmH2O，实验组术后第8周门静脉压力为(13.58±1.17) cmH2O(P＜0.05)。3.光镜下:实验组术后第2周肝细胞淤血、水肿，肝窦、肝中央静脉增宽;术后第4周肝颗粒变性，肝细胞普遍增大，胞浆淡染;术后第8周局灶性肝细胞萎缩、坏死，部分成纤维条索样改变。对照组呈正常组织结构。 结论：肝静脉丝线缩窄法可安全、有效地制备肝静脉型BCS动物模型。 第三部分 EPCs移植促进兔肝静脉型BCS肝静脉回流作用的实验研究 目的：探讨EPCs移植在兔肝静脉型BCS模型中改善肝静脉回流障碍的的作用机制。 方法：12只肝静脉型BCS模型兔（建模成功术后4周）随机分为EPCs移植组和对照组，每组各6只。EPCs移植组用5ml注射器抽取3mi浓度为(2～3)×106/ml EPCs的细胞悬液，超声引导下经门静脉途径缓慢输入。对照组经门静脉输入等体积的生理盐水。移植术后4周，所有兔均全麻下经CDUS检查肝静脉阻塞情况及肝脏回声变化，测量肝静脉、门静脉主干内径及平均血流速度、测算门静脉每分钟血流量;插管测定门静脉主干压力;处死动物，采集靶肝静脉及其引流区内的肝脏组织标本，进行HE染色、CD34免疫组化染色，光镜下观察肝组织结构变化，将实验组各观察点结果与对照组相应结果进行比较。 结果：1.EPCs移植术后，所有兔均未出现腹腔内出血、死亡等情况。2.CDUS示:所有兔靶肝静脉内膜增厚，管腔均狭窄，EPCs移植组和对照组无统计学差异(P＞0.05)。EPCs移植组、对照组靶肝静脉引流区肝实质分别呈均匀稍高回声、不均匀稍高回声。移植术后4周，对照组门静脉平均流速、血流量分别为(10.88±1.23)cm/s、(131.45±14.88) ml/min，EPCs移植组门静脉平均流速、血流量分别为(12.75±1.08) cm/s、(158.13±17.66) ml/min(P＜0.05);对照组门静脉压力为(13.50、±1.05) cmH2O，EPCs移植组为(12.17±0.75) cmH2O（P＜0.05）。3.大体观察:对照组肝脏表面欠光滑，质地较硬，表现为暗红色;EPCs移植组肝脏表面光滑，质地较软，呈现粉红色。4.光镜下:对照组肝细胞肿胀，局灶性肝细胞萎缩、坏死，部分区域成纤维条索样改变，肝静脉壁不光整，内膜增厚;EPCs移植组肝细胞肿胀程度较轻，门静脉分支血管增多，门脉血管沟通较明显，肝静脉壁光整;对照组肝静脉窦微血管密度计数(15.95±1.43)/HP，EPCs移植组(23.94±2.00)/HP(P＜0.05)。 结论：门静脉回输EPCs，可以促进兔肝静脉型BCS肝细胞损伤的修复，促进门静脉分支血管的生成，增加肝静脉窦微血管密度，改善肝静脉血液回流，降低门静脉压力。
布加综合征;肝静脉;门静脉;病理学;内皮祖细胞;动物模型
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
影像医学与核医学
张庆桥
2013
中文
R575
78
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）