CD11clowCD45RBhigh调节性DC对异基因骨髓移植小鼠GVHD和GVL的作用
目的：建立急性单核细胞白血病小鼠(AMOL)模型，观察CD11clowCD45RBhigh表型的调节性树突状细胞(DCreg)对异基因骨髓移植(allo-BMT)小鼠移植物抗宿主病(GVHD)及移植物抗白血病(GVL)的调控作用，为GVHD的防治提供实验依据。 方法：1、无菌条件下取C57BL/6小鼠的骨髓单个核细胞(MNC)，均匀接种至含有RPMI1640完全培养基的六孔板中，按组别分别加入不同的细胞因子，培养不同种类的树突状细胞(DC)。实验分为3组:①DCreg组:用含rmGM-CSF20ng/mL、IL-1020 ng/mL，TGF-β120 ng/mL的RPMI1640培养基培养7d，细菌脂多糖(LPS)刺激24 h使其成熟。②成熟树突状细胞(mDC)组，用含rmGM-CSF20 ng/mL、rm-IL-410 ng/mL的RPMI1640培养基培养6d，予LPS刺激24 h，使其成熟。③未成熟DC组(imDC)，用含rmGM-CSF20 ng/mL、rmlL-410 ng/mL的RPMI1640培养基中诱导培养7d。用倒置显微镜及透射电镜观察DC的形态及超微结构，流式细胞术鉴定其免疫表型;CCK-8法检测上述不同种类DC刺激异基因淋巴细胞增殖能力;趋化实验检测细胞迁移能力。2、建立白血病骨髓移植小鼠模型:以C57BL/6小鼠为供鼠，BALB/c小鼠为受鼠，BALB/c小鼠经致死剂量60Coγ射线全身照射(TBI)后4h内经尾静脉输注AMOL细胞株SHI-1细胞、供鼠骨髓MNC和脾脏MNC。实验分为5组:TBI组(n=5);AMOL组(n=10):即输注同基因小鼠骨髓MNC5×106/只和脾脏MNC5×105/只，同时输注SHI-1细胞1.2×107/只;allo-BMT组(n=15):即输注异基因小鼠骨髓MNC5×106/只和脾脏MNC5×105/只，同时输注SHI-1细胞1.2×107/只;imDC移植组(n=15):在allo-BMT的基础上输注imDC5×106/只;DCreg移植组(n=15):在allo-BMT的基础上输注DCreg5×106/只。通过受鼠GVHD临床评分、病理评分、异基因嵌合体、生存期等，观察输注DCreg、imDC对移植小鼠GVHD的影响，并通过白血病发生率、生存期评价GVL效应。 结果：1.DC细胞的鉴定:①倒置显微镜下观察小鼠骨髓MNC培养24 h后大部分贴壁生长，仅见少量悬浮细胞，培养3d左右，可见细胞呈现“葡萄”状生长的集落，培养至4d后可见细胞表面出现不规则树突状突起，呈现典型的DC形态，集落边缘也可见毛刺状突起，约5d时细胞逐渐从集落中释放出来，并悬浮生长;②透射电镜下观察到mDC放射状突起多而密集，细胞表面褶皱多;imDC、DCreg放射状突起较稀疏，细胞表面褶皱减少;③mDC高表达CD80、CD86、CD11c和IA/IE分子，imDC低表达CD80、CD86、IA/IE分子，高表达CD11c，与imDC相比DCreg高表达CD45RB，低表达CD11c及更低水平表达CD80、CD86。④DCreg组、imDC组增殖率明显低于mDC组，差异有统计学意义(P＜0.05)，而DCreg组增殖率最低(P＜0.05)。⑤DCreg组、imDC组迁移能力强于mDC组，(P＜0.05)，而DCreg组迁移能力最强（P＜0.05）。 2.DCreg对allo-BMT小鼠GVHD和GVL的影响:①白血病小鼠发病情况:AMOL组小鼠+25 d左右可见白血病细胞浸润眼球，28d内全部死亡，死亡原因为白血病，解剖小鼠可见肝脾明显肿大，肝脏散在白血病浸润病灶，组织病理学检查提示肝、脾、肺有白血病细胞浸润。②融合基因的检测:取AMOL组濒死的小鼠脾脏及肝脏组织检测其融合基因，最早于21d可检测出MLL/AF6;③嵌合体的检测:骨髓移植+18d，取allo-BMT组存活受鼠骨髓细胞经FCM检测嵌合体，H-2d阳性细胞占96.8％，提示完全嵌合;④DCreg组小鼠GVHD临床评分(3.8±0.68)，较allo-BMT组(7.6±0.99)、imDC组(4.93±0.96)均减低（P＜0.05）。⑤DCreg组小鼠GVHD靶器官肝、小肠、肺病理损伤程度均较轻，病理评分均较低(P＜0.05);⑥AMOL组小鼠白血病发病率为100％，allo-BMT组、imDC组及DCreg组小鼠白血病发病率40％、20％、10％，各组比较无统计学意义（P＞0.05）⑦小鼠存活情况:DCreg组小鼠+8 d开始死亡，+40 d有20％的小鼠存活，较allo-BMT组、imDC组受鼠均延长(P＜0.05)。 结论：1、应用细胞因子GM-CSF、IL-10和TGF-β1成功诱导培养出表型为CD11cloWCD45RBhighDCreg;2、输注CD11 cloWCD45RBhigh表型的DCreg可延长异基因骨髓移植小鼠的存活时间，在一定程度上减轻GVHD同时保留GVL效应。
调节性树突状细胞;细胞因子;移植物抗宿主病;异基因骨髓移植;急性单核细胞白血病;动物模型
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
内科学(血液病学)
黄一虹;徐开林
2013
中文
R733.71;R457.7
69
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）