SB203580通过阻断P38/CYLD通路抑制OGD诱导的神经元坏死样凋亡
目的：探讨p38mapkinase蛋白酶抑制剂(SB203580)在缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元坏死样凋亡(necroptosis)中的保护机制，并深入研究其是否与CYLD有关。 方法：SD大鼠原代皮质神经元细胞培养6天后，用神经元特异性标志物β-3Tubulin及DAPI染核观察神经元培养纯度;原代皮质神经元细胞培养14天，通过成熟神经元特异性标志物NeuN鉴定神经元，DAPI核染，同时用免疫荧光共定位观察目的蛋白CYLD在神经元内的定位;随后神经元经过ZVAD-fmk预处理30min，缺糖缺氧2小时，复灌不同时间观察CYLD蛋白量变化并选择表达量高峰时间点(0，2，6，8，12)为复灌时间;随后神经元被分为正常对照（Control组）、OGD组，缺糖缺氧2h，复灌8h，Western blot观察细胞浆、核内CYLD蛋白表达变化情况。然后实验组分为正常组、OGD组、OGD/DMSO组，OGD/ZVAD以及OGD/ZVAD/SB203580组，通过western blot、免疫荧光，比色法检测CYLD蛋白、SRF、P38蛋白及其磷酸化水平，LDH测定细胞受损程度。 结果：通过免疫荧光观察神经元特异性标 志物β-3Tubulin及DAPI染核显示神经元培养纯度在70％左右;在皮质神经元内通过NeuN和CYLD双染显示目的蛋白CYLD表达于胞浆、胞核，且胞核内强表达，胞浆内弱表达;随着缺糖缺氧后复灌时间的延长，CYLD蛋白表达量逐渐增加，8小时达到最高水平(P＜0.05)，与LDH检测的细胞受损程度相对应(P＜0.05);神经元在缺糖缺氧2h，复灌8h后，Control组和OGD组胞浆CYLD蛋白水平上调(P＜0.05)，两组胞核内CYLD蛋白水平无明显变化(P＞0.05)，且与后续免疫荧光结果一致;加入SB203580(0.5umol/l，1h)后，CYLD蛋白水平其他各组较Control组增高(P＜0.05)，OGD/ZVAD组较OGD组、OGD/DMSO组增高(P＜0.05)，并且OGD/ZVAD/SB203580组较OGD/ZVAD组降低(P＜0.05)，与免疫荧光及细胞分泌LDH水平一致。同时结果显示P38及SRF蛋白总蛋白水平无明显变化(P＞0.05)，其磷酸化水平在加入SB203580后下降（P＜0.05）。 结论：1、去泛素化酶CYLD存在于细胞核与细胞浆，且胞核强表达，胞浆弱表达，并且在胞质中介导坏死样凋亡的发生;2、SB203580对细胞的保护作用可能是通过阻断SRF的磷酸化水平，下调CYLD蛋白的表达，从而阻断CYLD介导的细胞坏死样凋亡。
神经元细胞;坏死性凋亡;p38mapkinase蛋白酶抑制剂;保护机制;去泛素化酶
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
神经病学
耿德勤
2013
中文
R741.02
58
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）