新生鼠MCMV感染早期Toll样受体及Th1/Th2类细胞因子水平的研究
目的:通过检测新生鼠鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus MCMV)感染前后脾淋巴细胞Toll样受体(Toll-like receptors)2、9和髓样分化因子(Myeloidcell differentiation MyD88)表达量及脾淋巴细胞培养上清液中Th1/Th2类细胞因子表达水平,探讨新生鼠MCMV感染早期天然免疫应答的启动及逃避免疫监视的可能机制,并寻求针对巨细胞病毒感染特异性免疫治疗的新途径。 方法:1.建立新生鼠全身播散型感染模型:MCMV经3T3细胞增殖后,在不使用免疫抑制剂条件下,新生小鼠腹腔接种MCMV悬液,建立MCMV全身播散型感染新生鼠模型。 2.实验分组:将64只新生鼠随机分为两组,MCMV模型组(32只)和正常对照组(32只),模型组按建模方法建立模型,对照组腹腔注射等量生理盐水,于模型后第3、5、7、10d取两组新生鼠各组织样本(每时间点各8只),无菌分离脾脏,制备脾淋巴细胞悬液,提取细胞蛋白,收集细胞培养上清液。 3.实时荧光定量PCR法检测MCMV模型组各组织中MCMV-DNA含量。 4.蛋白质印迹法(Western-blot)检测两组脾淋巴细胞TLR2、TLR9及MyD88表达水平。 5.夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测两组脾淋巴细胞培养上清液中IL-2、IFN-γ、IL-10表达水平。 6.采用经典相关分析(Pearson相关分析),分析④与⑤之间的相关性。 结果:1.模型组重要脏器(心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺)MCMV-DNA-PCR后琼脂糖凝胶电泳100bp处可见阳性条带,而对照组则没有阳性表达;模型组在不同时间点实时荧光定量PCR可见不同程度MCMV-DNA扩增。 2.TLR2、TLR9、MyD88蛋白在模型组第3d时表达与正常组比较,差异无统计学意义(t分别为2.02,-0.74和0.00,P均>0.05);第5d时蛋白表达开始增加,与对照组比较,差异有统计学意义(t分别为43.58,17.32和20.52,P均<0.01);第7d达高峰,与同组第5d比较,差异均有统计学意义,(t分别为5.30,10.96和13.07,P均<0.01);与同组第10d比较,差异均有统计学意义,(t分别为4.06,4.45和14.20,P均<0.05),第10d时开始下降,与对照组比较,差异有统计学意义(t分别为13.97,10.14和21.37,P均<0.01)。 3.模型组小鼠中,脾淋巴细胞上清液中IL-2表达水平第3d开始下降,与对照组比较,差异有统计学意义(t=-1.53,P<0.05),第7d时降至最低水平,与同组前、后时间点比较,差异均有统计学意义(t分别为-10.76,-3.84,P均<0.05);IFN-γ表达水平第3d开始升高,与对照组比较,差异有统计学意义(t=3.30,P<0.01),第5d时迅速达高峰,与同组前、后两时间点比较,差异均有统计学意义(t分别为14.66,15.90,P均<0.01),后逐渐下降至基线水平,与对照组比较,差异无统计学意义(t=1.18,P>0.05);IL-10第5d时开始升高,呈现逐渐上升的趋势,与对照组比较,差异均有统计学意义(t分别为9.60,5.83和16.37,P均<0.05)。 4.TLR2、TLR9、MyD88蛋白浓度与IL-2含量成负相关(r=-0.978,r=-0.960,r=-0.979,P均<0.001);与IFN-γ的含量无线性相关(r=0.126,r=0.170,r=0.333,P均>0.05);与IL-10含量成正相关(r=0.954,r=0.914,r=0.892,P均<0.001)。 结论:1.在不使用免疫抑制剂条件下,通过腹腔接种MCMV悬液可建立新生鼠MCMV全身播散型感染模型,为巨细胞病毒感染治疗药物筛选、疗效评价、疾病发病机制及疾病预后评估提供良好的研究平台。 2.MCMV感染早期(感染7d前),可刺激机体天然免疫应答,上调TLRs表达,进一步活化获得性免疫应答,通过MyD88依赖途径刺激IFN-γ的分泌,在感染早期起到一定抑制MCMV复制的作用。 3.MCMV感染中后期(感染7d后),引起机体一系列细胞因子表达水平变化,造成Th1/Th2免疫平衡失调,表现为Th2的优势反应状态,是宿主特异性细胞免疫功能降低的原因之一。
新生儿疾病;巨细胞病毒;Toll样受体;细胞因子;免疫机制
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
儿科学
王军
2013
中文
R722.130.2
60
2014-02-25(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)