新生鼠MCMV感染早期Toll样受体及Th1/Th2类细胞因子水平的研究
目的：通过检测新生鼠鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus MCMV)感染前后脾淋巴细胞Toll样受体(Toll-like receptors)2、9和髓样分化因子(Myeloidcell differentiation MyD88)表达量及脾淋巴细胞培养上清液中Th1/Th2类细胞因子表达水平，探讨新生鼠MCMV感染早期天然免疫应答的启动及逃避免疫监视的可能机制，并寻求针对巨细胞病毒感染特异性免疫治疗的新途径。 方法：1.建立新生鼠全身播散型感染模型:MCMV经3T3细胞增殖后，在不使用免疫抑制剂条件下，新生小鼠腹腔接种MCMV悬液，建立MCMV全身播散型感染新生鼠模型。 2.实验分组:将64只新生鼠随机分为两组，MCMV模型组（32只）和正常对照组(32只)，模型组按建模方法建立模型，对照组腹腔注射等量生理盐水，于模型后第3、5、7、10d取两组新生鼠各组织样本（每时间点各8只），无菌分离脾脏，制备脾淋巴细胞悬液，提取细胞蛋白，收集细胞培养上清液。 3.实时荧光定量PCR法检测MCMV模型组各组织中MCMV-DNA含量。 4.蛋白质印迹法(Western-blot)检测两组脾淋巴细胞TLR2、TLR9及MyD88表达水平。 5.夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测两组脾淋巴细胞培养上清液中IL-2、IFN-γ、IL-10表达水平。 6.采用经典相关分析(Pearson相关分析)，分析④与⑤之间的相关性。 结果：1.模型组重要脏器（心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺）MCMV-DNA-PCR后琼脂糖凝胶电泳100bp处可见阳性条带，而对照组则没有阳性表达;模型组在不同时间点实时荧光定量PCR可见不同程度MCMV-DNA扩增。 2.TLR2、TLR9、MyD88蛋白在模型组第3d时表达与正常组比较，差异无统计学意义（t分别为2.02，-0.74和0.00，P均＞0.05）;第5d时蛋白表达开始增加，与对照组比较，差异有统计学意义（t分别为43.58，17.32和20.52，P均＜0.01）;第7d达高峰，与同组第5d比较，差异均有统计学意义，（t分别为5.30，10.96和13.07，P均＜0.01）;与同组第10d比较，差异均有统计学意义，（t分别为4.06，4.45和14.20，P均＜0.05），第10d时开始下降，与对照组比较，差异有统计学意义（t分别为13.97，10.14和21.37，P均＜0.01）。 3.模型组小鼠中，脾淋巴细胞上清液中IL-2表达水平第3d开始下降，与对照组比较，差异有统计学意义（t=-1.53，P＜0.05），第7d时降至最低水平，与同组前、后时间点比较，差异均有统计学意义（t分别为-10.76，-3.84，P均＜0.05）;IFN-γ表达水平第3d开始升高，与对照组比较，差异有统计学意义（t=3.30，P＜0.01），第5d时迅速达高峰，与同组前、后两时间点比较，差异均有统计学意义（t分别为14.66，15.90，P均＜0.01），后逐渐下降至基线水平，与对照组比较，差异无统计学意义（t=1.18，P＞0.05）;IL-10第5d时开始升高，呈现逐渐上升的趋势，与对照组比较，差异均有统计学意义(t分别为9.60，5.83和16.37，P均＜0.05)。 4.TLR2、TLR9、MyD88蛋白浓度与IL-2含量成负相关（r=-0.978，r=-0.960，r=-0.979，P均＜0.001）;与IFN-γ的含量无线性相关(r=0.126，r=0.170，r=0.333，P均＞0.05);与IL-10含量成正相关（r=0.954，r=0.914，r=0.892，P均＜0.001）。 结论：1.在不使用免疫抑制剂条件下，通过腹腔接种MCMV悬液可建立新生鼠MCMV全身播散型感染模型，为巨细胞病毒感染治疗药物筛选、疗效评价、疾病发病机制及疾病预后评估提供良好的研究平台。 2.MCMV感染早期（感染7d前），可刺激机体天然免疫应答，上调TLRs表达，进一步活化获得性免疫应答，通过MyD88依赖途径刺激IFN-γ的分泌，在感染早期起到一定抑制MCMV复制的作用。 3.MCMV感染中后期（感染7d后），引起机体一系列细胞因子表达水平变化，造成Th1/Th2免疫平衡失调，表现为Th2的优势反应状态，是宿主特异性细胞免疫功能降低的原因之一。
新生儿疾病;巨细胞病毒;Toll样受体;细胞因子;免疫机制
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
儿科学
王军
2013
中文
R722.130.2
60
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）