肝静脉闭塞病中与Notch1信号通路相互作用的lncRNA的筛选及初步验证
目的:本实验旨在研究Notch1信号通路对异基因造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)后肝静脉闭塞病(hepaticveno-occlusive disease,HVOD)受损肝细胞的修复作用,并通过肝细胞基因芯片筛选与Notch1信号通路相互作用的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA),并进一步分析lncRNA与Notch1信号通路之间的相互作用关系。 方法:1.将8~10周龄雄性BALB/c(H-2d)小鼠经致死剂量全身照射(totalbody irradiation,TBI)后,随机分为TBI组及异基因HSCT组,正常小鼠为对照组。移植当天为0天,分别于移植后第0、7、14及33天取受鼠肝脏称重后计算肝脏指数,留取血浆检测肝功能(胆红素、ALT和AST)及细胞因子(TNF-α、TGF-β、IL-1、IL-6及HGF);HE染色观察肝脏组织受损情况,电镜观察肝细胞超微结构变化;2.TBI及HSCT后第0、7、14及33天,percoll密度梯度离心法分离、纯化受鼠肝细胞,分别用实时荧光定量PCR及Western blot检测肝细胞内Notch1信号通路相关分子的mRNA及蛋白水平变化;3.提取肝细胞总RNA,经质量及完整性检测后,用于制作肝细胞lncRNA基因芯片;4.对基因芯片数据进行整理、分析,筛选与Notch1信号通路相互作用的lncRNAs,荧光定量PCR检测与Notch1信号通路相互作用lncRNAs的mRNA水平,并进一步分析Notch1信号通路分子与其相互作用lncRNAs的同源性。 结果:1.TBI及HSCT对肝脏的损伤:TBI组小鼠在11天内全部死亡,病理显示照射后第7天肝窦内皮脱落、肝细胞水肿并出现少量点状坏死,此时小鼠肝指数水平也达到最高,胆红素、ALT及AST水平高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05),至第10天肝细胞损伤进一步加重,肿胀、坏死较前增多,肝窦内有出血,肝小叶结构不清。而HSCT后第7天,受鼠肝细胞损伤较同时间点TBI组小鼠重,至第14天肝细胞损伤最严重,肝细胞肿胀、坏死、肝窦内皮脱落、Disse间隙水肿并肝窦内出血,此时小鼠肝指数水平亦达最高,肝功能较前虽下降,但仍高于正常水平,差异有统计学意义(P<0.05);至第33天肝细胞损伤虽较前好转,但炎性细胞浸润增多,且受鼠肝指数及肝功能在HSCT后33天内持续高于正常水平,提示移植后肝脏损伤由TBI和HSCT共同引起。2.照射及HSCT后,肝细胞内Notch1通路分子的mRNA水平呈先降后升的趋势,在第14天时降至最低,随后其表达水平升高,Notch1信号通路分子蛋白水平变化趋势与mRNA水平变化趋势相同。3.成功分离、纯化移植后受鼠的肝细胞,并提取肝细胞总RNA,琼脂糖凝胶电泳快速检测RNA完整性良好,可用于基因芯片制作。4.经过对肝细胞基因芯片数据整理、分析,筛选出与差异性表达显著的Notch1通路分子Notch1、Dl14及Hes7相互作用的lncRNAs0610009E02Rik、Gm14207及AL645527.1,进一步研究发现这些lncRNAs与Notch1、Dl14及Hes7具有显著相关性。5、同源性分析表明lncRNAs0610009E02Rik与Notch1具有同源性。 结论:1.照射及HSCT共同作用,损伤肝窦内皮和肝细胞、破坏肝功能,致细胞因子分泌紊乱,引起肝细胞不可逆性损伤;2.Notch1信号通路参与移植后受损肝细胞的修复;3.lncRNA0610009E02Rik是Notch1的正性调节子,参与移植后HVOD受损肝细胞的修复。
肝静脉闭塞病;Notch1信号通路;长链非编码RNA;基因筛选
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
血液病学
曾令宇;徐开林
2013
中文
R575.02
95
2014-02-25(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)