高糖环境下mTOR在肾小管上皮间质转化中的作用及机制研究
目的：研究大鼠肾小管上皮细胞中高糖诱导的活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的激活作用，以及mTOR对肾小管上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)的影响，并探讨其可能的分子机制。 方法：本实验主要通过体外培养大鼠肾小管上皮细胞（normal rat kidneytubular epithelial cell line，NRK-52E）进行研究。培养的细胞分为正常组(normalglucose group，NG组)、高糖组(high glucose group，HG组)、过氧化氢组(H2O2组)、转化生长因子-β1组（Transforming Growth Factor-β1 group，TGF-β1组），抗氧化剂组(N-acetyl-L-cysteine group，NAC组)、TGF-β1抑制剂组(SB-431542group，SB-431542组)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)抑制剂组(LY-294002 group，LY-294002组)、mTOR抑制剂组(Rapamycin group，Rapamycin组)。分别在培养48 h时检测以下各项指标:倒置显微镜下观察细胞形态变化;流式细胞仪检测细胞中活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的水平;ELISA法检测细胞TGF-β1分泌量;Western blotting法测定细胞中蛋白激酶B(protein kinase B,Akt/KB), p-Akt(Ser473), mTOR, p-mTOR(Ser2448),E-钙粘蛋白(E-cadherin)，α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin，α-SMA)的蛋白表达水平;Real time RT-PCR法测定TGF-β1 mRNA、E-cadherin mRNA、α-SMA mRNA的相对含量。 结果：1.细胞形态变化各组细胞培养48h后，与NG组比较，HG组、TGF-β1组、H2O2组细胞形态由铺路石样转变为梭形纤维样;与HG组相比，NAC组、LY-294002组、SB-431542组、Rapamycin组细胞形态较规则，呈铺路石样。 2.ROS的变化与NG组比较，HG组在48 h ROS释放量增加，差异有统计学意义(P＜0.01);与HG组相比较，NAC组ROS的生成量减少，且差异有统计学意义(P＜0.01)。 3.TGF-β1分泌水平及其mRNA的变化与NG组比较，HG组、H2O2组TGF-β1mRNA及蛋白分泌水平显著提高(P＜0.05或P＜0.01);与HG组比较，NAC组TGF-β1mRNA及分泌量明显下降(P＜0.05或P＜0.01)。 4.Akt蛋白磷酸化水平的变化各组间总Akt(T-Akt)蛋白表达量的差异无统计学意义(P＞0.05);与NG组比较，HG组、TGF-β1组、H2O2组p-Akt/T-Akt值显著升高(P＜0.05);与HG组比较，NAC组、LY-294002组、SB-431542组p-Akt/T-Akt值降低(P＜0.05)。 5.mTOR蛋白磷酸化水平的变化各组间总mTOR(T-mTOR)蛋白表达量的差异无统计学意义（P＞0.05）;与NG组比较，HG组、TGF-β1组、H2O2组p-mTOR/T-mTOR值升高(P＜0.01);与HG组比较，NAC组、LY-294002组、SB-431542组、Rapamycin组p-mTOR/T-mTOR值均降低(P＜0.05或＜0.01)。 6.E-cadherin、α-SMA表达的差异与NG组比较，HG组、TGF-β1组、H2O2组E-cadherin mRNA水平及其蛋白表达均降低(P＜0.01或P＜0.05)，α-SMA mRNA水平及其蛋白表达均升高，（P＜0.01）;与HG组比较，NAC组、LY-294002组、SB-431542组、Rapamycin组E-cadherin mRNA水平其蛋白表达均升高(P＜0.01或P＜0.05)，α-SMA mRNA水平及其蛋白表达均降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。 结论：1.高糖状态下，大量生成的ROS可通过上调TGF-β1表达，激活其下游PI3K/Akt信号通路，进而促进mTOR的磷酸化。2.高糖状态下，mTOR的激活可促进肾小管EMT，进一步加剧肾间质纤维化。
肾小管上皮细胞;高糖环境;雷帕霉素靶蛋白;分子机制
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
药理学
印晓星
2013
中文
R692.02
63
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）