基于体内外指纹图谱共有峰定性定量的银黄制剂的质量控制及潜在活性成分研究
目的:建立银黄制剂体外指纹图谱和体内血浆指纹图谱并标定共有峰,通过对体内外共有峰的定性定量分析,探究银黄制剂的质量控制方式及潜在活性成分。 方法:第一节利用高效液相色谱-二极管阵列检测器(high performance liquidchromatography/diode-array detection,HPLC-DAD)建立银黄制剂包括颗粒、胶囊和含片的体外指纹图谱,并对共有峰进行标定,利用HPLC-DAD对共有峰中的绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、黄芩苷、木犀草素、千层纸素A-O-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A等10种活性成分进行含量测定;利用液相色谱质谱联用仪(liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry,LC-MS)对银黄制剂的指纹图谱共有峰进行定性分析。采用Sepax GP-C18柱(250mm×4.6 mm,5μm),0.1%甲酸甲醇溶液(A)-0.1%甲酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱。流速:1.0 mL/min;指纹图谱分析检测波长为320 nm,黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、千层纸素A-O-葡萄糖醛酸苷的检测波长为275 nm,绿原酸和咖啡酸的检测波长为320 nm,木犀草苷和木犀草素的检测波长为350 nm。柱温:30℃;进样量:20μL。采用三重四级杆质谱仪,采用电喷雾(electrospray ionization,ESI)离子源,负离子模式(ESI-)检测,柱后分流比为3∶1,毛细管电压3500 V,雾化气压力20 psi,干燥气流速10 L/min,干燥气温度320℃,碎裂电压110V。 第二节利用超高效液相-二极管阵列检测器(ultra high performance liquidchromatography/diode-array detection,UPLC-DAD)建立大鼠口服银黄制剂后的血浆指纹图谱并标定共有峰,利用LC-MS对共有峰进行定性分析,利用UPLC-DAD定量血浆指纹图谱共有峰中黄芩苷、千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷,并应用于其药物动力学研究。定性分析:采用Agilent Eclipse Plus C18柱(2.1×50 mm,1.8μm);流动相:0.2%甲酸水溶液(A)、乙腈(B),梯度洗脱,流速0.4 mL/min,进样量2μL;柱温:30℃,采用三重四级杆质谱仪,采用ESI离子源,负离子模式(ESI-)检测,毛细管电压3500 V,雾化气压力20 psi,干燥气流速10 L/min,干燥气温度320℃,碎裂电压110 V; SD大鼠按银黄颗粒5 g/kg剂量给药,每天两次,连续三天,于末次给药后2h眼眶取血300μL,以0.1%甲酸乙腈溶液为蛋白沉淀剂,定性分析血浆中的移形成分。定量分析及药物动力学:色谱条件同大鼠血浆指纹图谱定性分析条件,检测波长选择275 nm。芦丁为内标,以大鼠为实验动物,分别于给药前及给予银黄颗粒(5 g/kg,折合黄芩苷502.1 mg/kg)、黄芩苷(501.1 mg/kg)、黄芩药材(15 g/kg,折合含黄芩苷502.7 mg/kg)后于0.25,0.5,1,1.5,2,4,6,8,12,24,48 h眼眶取血300μL,以0.1%甲酸乙腈溶液为蛋白沉淀剂,利用WinNonlin6.0软件进行药动学参数的计算,考察黄芩苷、千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷三种成分在大鼠灌胃后的药代动力学参数及不同给药方式之间的差异。 结果:第一节不同厂家银黄制剂指纹图谱相似度均大于0.89,各批次样品间的共有峰的相对峰面积相差较大。定量分析:10个组分的线性、回收率、日内和日间精密度、准确度、最低定量限(limit of detection,LOD)、最低检测限(limit ofquantification,LOQ)、重复性和稳定性结果良好,符合定量分析的要求,不同厂家及相同厂家不同批次的银黄制剂之间10种化学成分含量差异较大。定性分析:在对指纹图谱20个共有峰的定性分析中,共确认和推测出了18个化合物,其中7种酚酸类化合物均来源于金银花,分别为3-O-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸;2种环烯醚萜类化合物来源于金银花,分别为马钱子苷和段氧化马钱子苷;9种黄酮类化合物均来源于黄芩,分别为木犀草苷、木犀草素、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、千层纸素A、千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、野黄芩苷。 第二节通过对血浆指纹图谱共有峰的标示,在大鼠血浆中共测到了14种移行成分,其中原型成分有10种,均来源于黄芩苷,分别为木犀草苷、黄芩苷、木犀草素、千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A及两种体外定性分析中未确定结构的化合物;新出现的成分有4种,其中一种可能为5,6,7-三羟基黄酮-6-O-葡萄糖醛酸苷,另外3种化合物有待进一步确认。入血成分中黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A-O-葡萄糖醛酸苷含量较高,经过对其进一步药动学实验,三种化合物的药-时曲线均出现多峰,由药动学参数比较,大鼠口服给予黄芩苷与口服给予黄芩药材和银黄制剂后,血浆中黄芩苷的T1/2、 Tmax、曲线下面积(area under curve,AUC)等参数差异显著,黄芩药材组和银黄制剂组之间黄芩苷的Tmax、AUC无显著性差异。提示,中药中多组分并存,影响单一组分的药物动力学行为。 结论:指纹图谱与多组分定量相结合可有效控制银黄制剂的质量,体内外共有峰定性分析结果提示3-O-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、马钱子苷、段氧化马钱子苷、木犀草苷、木犀草素、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、千层纸素A、千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、野黄芩苷、5,6,7-三羟基黄酮-6-O-葡萄糖醛酸苷及5种未知成分等均可能为银黄制剂的潜在活性成分。银黄制剂的多种成分之间可能通过相互影响药物动力学行为而发挥其防病治病的协同作用。
银黄制剂;体内外指纹图谱;共有峰;定性定量分析;质量控制;药理活性
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
药理学
印晓星;汤道权
2013
中文
R285
93
2014-02-25(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)