rhGLP-1(7-36)对糖尿病合并脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及机制研究
文章主要从以下几方面进行了论述。 第一部分SD大鼠2型糖尿病模型的建立。 目的:建立类似于人类2型糖尿病病理生理特征的大鼠糖尿病模型,为后期实验提供2型糖尿病动物模型。 方法:采用高脂饲料喂养4周诱导胰岛素抵抗,再用腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ,30 mg/kg)诱导胰岛损伤的方法建立糖尿病模型;将大鼠随机分成普通饲料饲养的正常对照组,高脂饲料喂养的模型对照组和模型组;Lee's指数评价肥胖程度;ELISA法测定血浆胰岛素(INS),甘油三酯(TG),总胆固醇(TC)及游离脂肪酸(FAA);血糖仪测定血糖,成模标准为空腹血糖≥11.0 mmol/L;SPSS16.0进行统计分析,P<0.05表明差异有统计学意义。 结果:与正常对照组相比,高脂饲料组在喂养4周后出现肥胖、胰岛素抵抗及血脂代谢紊乱,模型组给予STZ后出现多饮多尿,体重减轻等现象,以及空腹血糖升高,胰岛素敏感性指数降低等生化改变;造模成功率为50%,死亡率为7.41%。 结论:本实验采用的造模方法,成功建立了符合临床2型糖尿病特点的动物模型。 第二部分HPLC/MS/MS法测定大鼠脑内EAAs含量方法学建立。 目的:采用HPLC/MS/MS技术建立一种快速、灵敏、准确的检测脑组织内兴奋性氨基酸的实验方法。 方法:采用Agilent1200型高效液相色谱系统和AB SCIEX QTRAP5500型三重四级杆串联质谱系统;以HYPERSIL GOLD为预柱,Restek C18为分离柱,流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为乙腈,A∶B=40∶60等梯度洗脱;质谱分析条件为阳离子模式下多重反应监测(MRM),用于定量分析的GLU离子为m/z142.1→84.1,ASP离子为m/z134→74,内标(GLU-d5)为m/z153.1→88;采用Analyst1.5.2进行数据定量分析,SPSS16.0进行统计分析,检验水准α=0.05,P<0.05表明差异有统计学意义。 结果:GLU、ASP、GLU-d5的保留时间分别为1.63 min、2.33 min、1.61 min,分离度好,峰形良好,无杂质峰干扰;在10~1000 ng/ml标准曲线范围内,线性良好,r2大于0.99,定量下限为10 ng/ml; GLU和ASP的日内精密度(RSD)分别为1.0%~11.0%和2.0%~12.0%,日间精密度(RSD)分别为4.0%~5.0%,3.0%~5.0%,准确度分别为88.4%~116.0%和85.8%~116.0%;在10 ng/ml、100 ng/ml、1000 ng/ml浓度下,回收率分别为0.79±0.24、1.01±0.10、0.90±0.12和0.99±0.26、0.93±0.07、1.13±0.13;GLU和ASP的稀释效应为11.59±2.29%和10.81±1.73%;样本室温条件下稳定。 结论:该分析方法的特异性、线性、灵敏度、准确度均符合生物样品质量分析要求,稀释效应对检测结果基本无影响,在本实验室环境下可用于定量检测大鼠脑组织内兴奋性氨基酸含量。 第三部分 rhGLP-1(7-36)对糖尿病合并脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及机制研究 目的:1.考察rhGLP-1(7-36)对糖尿病合并脑缺血再灌注损伤的脑保护作用疗效;2.初步探讨rhGLP-1(7-36)发挥脑保护作用的机制。 方法:通过高脂饲料饮食加小剂量STZ诱导胰岛损伤的方法建立SD大鼠2型糖尿病模型,再在糖尿病模型的基础上建立MCAO/R模型,将糖尿病合并MCAO/R模型组大鼠随机分为假手术组,模型对照组,尼莫地平组,胰岛素组,rhGLP-1(7-36)低、中、高剂量组,通过观察大鼠给药后神经功能缺损评分改善程度,TTC染色后各组大鼠脑梗死面积,以及HE染色观察各组大鼠脑组织病理形态改变来评价rhGLP-1(7-36)的脑保护作用;测定各组大鼠给药后30 min血糖变化,来评价rhGLP-1(7-36)的降糖疗效;通过ELISA法测定脑组织内SOD、MDA、GSH-PX、iNOS、eNOS含量变化,HPLC/MS/MS法来测定脑组织内GLU、ASP含量变化来探讨rhGLP-1(7-36)发挥脑保护作用的机制;用SPSS16.0对数据进行统计分析,P<0.05表明差异有统计学意义。 结果: 1.rhGLP-1(7-36)对糖尿病合并MCAO/R大鼠神经功能评分影响 手术成功大鼠出现偏瘫症状,与模型对照组比较,尼莫地平组、胰岛素组、rhGLP-1(7-36)中、高剂量组在数值上均有改善神经功能缺损状态的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。 2.rhGLP-1(7-36)对脑梗死面积影响 与模型对照组比较(vs.31.90±7.86%),尼莫地平组(21.10±19.82%,P<0.05)、胰岛素组(14.68±11.58%,P<0.05)、rhGLP-1(7-36)中剂量组(13.54±8.64%,P<0.01)、高剂量组(16.97±15.74%,P<0.01)均能减少脑梗死面积;rhGLP-1(7-36)各组与尼莫地平组比较差异无统计学意义(P>0.05)。 3.rhGLP-1(7-36)对脑组织病理影响 rhGLP-1(7-36)各组与模型对照组相比,脑组织水肿空泡数量明显减少,尼氏小体数目增多,排列更加规律,紧密,血管增生增加。 4.rhGLP-1(7-36)对血糖的影响 与模型对照组相比,rhGLP-1(7-36)高剂量组给药后30 min血糖下降最显著(P<0.01),与胰岛素组比较,rhGLP-1(7-36)低剂量组血糖下降程度低(P<0.01),中、高剂量组与胰岛素组差异无统计学意义。 5.rhGLP-1(7-36)对脑组织内SOD、MDA、GSH-PX、iNOS、eNOS的影响 与模型对照组比较,rhGLP-1(7-36)中、高剂量组脑组织内SOD活性显著增加(P<0.01),与尼莫地平组比较,rhGLP-1(7-36)中、高剂量组增高更显著(P<0.05,P<0.01);rhGLP-1(7-36)低、中、高剂量组GSH-PX活性较模型对照组升高(P<0.05,P<0.01,P<0.01),较尼莫地平组升高更显著(P<0.05,P<0.01,P<0.01);rhGLP-1(7-36)低、中、高剂量组较模型对照组,MDA含量降低(P<0.01,P<0.01,P<0.01),较尼莫地平组rhGLP-1(7-36)高剂量组下降更为明显(P<0.01); rhGLP-1(7-36)低、中、高剂量组较模型对照组,iNOS活性降低(P<0.01,P<0.01,P<0.01),较尼莫地平组差异无统计学意义;rhGLP-1(7-36)高剂量组较模型对照组,eNOS活性升高(P<0.05)。 6.rhGLP-1(7-36)对脑组织内兴奋性氨基酸含量的影响 与模型对照组比较,rhGLP-1(7-36)中、高剂量组脑组织内GLU含量降低(P<0.05,P<0.05),与尼莫地平组比较差异无统计学意义;与模型对照组比较,胰岛素组ASP含量下降最为明显,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论: 1.rhGLP-1(7-36)能改善糖尿病合并脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损状况,减轻脑组织损伤,对脑缺血再灌注损伤有保护作用。 2.rhGLP-1(7-36)能够降低血糖,从而达到治疗糖尿病的作用。 3.rhGLP-1(7-36)能够增加脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织内SOD、GSH-PX、eNOS活性,降低iNOS活性,降低MDA、GLU含量,从而抑制氧化应激损伤,抑制NO损伤,抑制兴奋性氨基酸毒性作用,减轻脑缺血再灌注损伤。
糖尿病;脑缺血再灌注损伤;重组人类胰高血糖素肽-1;疗效评价
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
药理学
印晓星;方翼
2013
中文
R587.105
100
2014-02-25(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)