大黄化学组分的提取分离及其对肾小球系膜细胞增殖的抑制作用
文章主要从以下几方面进行了论述。 第一部分药学研究。 目的：提取分离大黄化学组分。 方法：采用6种型号的大孔树脂(D101、X-5、AB-8、DM301、DM130、DA201)对大黄化学组分进行分离，以大黄酸与大黄素含量作为指标成分，用高效液相色谱(HPLC)检测分析其分离效果。 结果：各型号的大孔树脂分离大黄酸与大黄素的得率D101(0.2796％;0.1359％)、X-5(0.6947％;0.2190％)、AB-8(0.6458％;0.3206％)、DM301(0.5839％;0.1297％)、DM130(0.7202％;0.3408％)、DA201(0.4622％;0.2337％)，其中DM130得率最高，经HPLC分析，30％、60％洗脱组成分未知，90％洗脱组为大黄游离葸醌，其主要化合物为大黄酸、大黄素、芦荟大黄素，纯度为90％。 结论：经DM130分离得到的90％乙醇洗脱组为大黄游离蒽醌，其主要成分为大黄酸、大黄素、芦荟大黄素，纯度为90％，符合药用标准。 第二部分药理学研究。 目的： 1.模型建立:分别用高糖(30 mmol/L)及正常葡萄糖(5.56 mmol/L)培养大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cell，MC)，观察其对MC增殖的影响，建立高糖状态下MC增殖病理模型。 2.大黄活性组分筛选:分别用30％、60％组分及游离蒽醌刺激高糖培养下的MC，观察其对MC增殖的影响，筛选出大黄中的活性组分。 3.探讨大黄游离蒽醌对高糖培养下MC中相关基因表达的调控作用及基质蛋白分泌的影响，探讨其作用机制。 方法： 1.大黄活性组分筛选 将经传代的MC同步化后分组:NG组（5.56 mmol/L葡萄糖）、MA组(5.56mmol/L葡萄糖+24.44 mmol/L甘露醇)、HG组（30 mmol/L葡萄糖）、RM组(30mmol/L葡萄糖+1‰ DMSO)、30G组(0.25、0.5、1、5、10、20、40μg/ml+30 mmol/L葡萄糖+1‰ DMSO)、60G组(0.25、0.5、1、5、10、20、40μg/ml+30 mmol/L葡萄糖+1‰DMSO)、FARG组(0.25、0.5、1、5、10、20、40μg/ml+30 mmol/L葡萄糖+1‰DMSO)，刺激12h、24h、48 h，采用CCK-8法，用酶标仪于450 nm波长测定OD值。 2.大黄游离蒽醌对MC相关基因表达的调控作用及基质蛋白分泌的影响 将经传代的MC同步化后分组:NG组（5.56 mmol/L葡萄糖）、MA组(5.56mmol/L葡萄糖+24.44 mmol/L甘露醇)、HG组(30 mmol/L葡萄糖)、RM组(30mmol/L葡萄糖+1‰DMSO)、FARL组（5μg/ml+30 mmol/L葡萄糖+1‰DMSO）、FARM组（10μg/ml+30 mmol/L葡萄糖+1‰DMSO）、FARH组（20μg/ml+30mmol/L葡萄糖+1‰DMSO），刺激12h、24 h、48 h，RT-PCR法检测MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol和FN mRNA表达;ELISA法检测MC上清中TGF-β1、CTGF、ⅣCol和LN的蛋白含量。 结果： 1.大黄活性组分的筛选 1.1模型建立:与NG组比较，HG组OD值明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。 1.2与Rm组比较，HG组OD值无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。 1.3与HG组比较，12h，30G组、60G组、FARG组OD值明显下降，随着时间延长，OD值下降更加显著，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中，30G组和60G组在48h，20μg/ml时OD值明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，而FARG组在48 h，5μg/ml时OD值明显下降，且随着剂量的增加，OD值下降愈显著，差异有统计学意义(P＜0.05)。 2.大黄游离蒽醌对MC中TGF-β1、CTGF、Ⅳ Col、FN基因表达的调控作用及TGF-β1、CTGF、ⅣCol、LN蛋白分泌的影响 2.1模型建立:与NG组比较，HG组MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、FN的、基因表达及TGF-β1、CTGF、ⅣCol、LN蛋白分泌明显上升，差异有统计学意义(P＜0.05)。 2.2对MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、FN基因表达的调控作用: 与RM组比较，HG组MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、FN的基因表达，差异无统计学意义(P＞0.05)。 与HG组比较，12h，FAR各组MC中TGF-β1基因表达有下降趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05);24 h，FARM、FARH组MC中TGF-β1基因表达下降，差异有统计学意义(P＜0.05);48 h，FAR各组MC中TGF-β1基因表达下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。12h，FARM、FARH组MC中CTGF基因表达下降，差异有统计学意义(P＜0.05);24h，FAR各组MC中CTGF基因表达均下降，差异有统计学意义(P＜0.05);48h，FARH组MC中CTGF基因表达下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。12h，24 h，48 h，FAR各组MC中Ⅳ Col基因表达均下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。12h，FARM、FARH组MC中FN基因表达明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05);24h，FARH组MC中FN基因表达明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05);48h，FAR各组MC中FN基因表达明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。 3.对MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、LN基质蛋白分泌的影响 与RM组比较，HG组中MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、LN基质蛋白的分泌，差异无统计学意义(P＞0.05)。 与HG组比较，12h，FAR各组MC中TGF-β1蛋白分泌有下降趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05);24h，FAR各组MC中TGF-β1基质蛋白分泌下降，差异有统计学意义(P＜0.05);48h，FARM、FARH组MC中TGF-β1蛋白分泌降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。12h、24h，FAR各组MC中CTGF蛋白分泌均下降，差异有统计学意义(P＜0.05);48h，FAR各组MC中CTGF蛋白分泌有下降趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。12h，FARH组MC中ⅣCol蛋白分泌降低，差异有统计学意义(P＜0.05);24h，FARM、FARH组MC中ⅣCol蛋白分泌降低，差异有统计学意义(P＜0.05);48h，FAR各组MC中ⅣCol蛋白分泌无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05)。12h，FARM组MC中LN蛋白分泌均下降，差异有统计学意义(P＜0.05);24h，FARL、FARM组MC中LN蛋白分泌均下降，差异有统计学意义(P＜0.05);48h，FAR各组MC中LN蛋白分泌有下降趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。 结论： 1.大黄活性组分筛选 1.1高糖能显著地促进了MC增生，说明MC增殖模型符合实验要求。 1.230％、60％组分、游离蒽醌均能抑制高糖培养的MC增殖，但是大黄游离蒽醌的作用优于其它两组，且表现出一定的剂量和时间依赖性，因此，筛选出大黄游离蒽醌的剂量组:5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml，进一步研究其对MC基质分泌的影响。 2.大黄游离蒽醌对MC基质分泌的影响 2.1与NG组比较，HG组MC中TGF-β1、CTGF、Ⅳ Col、FN基因表达及TGF-β1、CTGF、Ⅳ Col、LN蛋白分泌明显升高，说明高糖可刺激MC细胞外基质的分泌。 2.2与RM组比较，HG组MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、FN基因表达及TGF-β1、CTGF、Ⅳ Col、LN蛋白分泌无显著性差异，提示DMSO对实验结果无影响。 2.3在20μg/ml，24 h时，大黄游离蒽醌能显著抑制TGF-β1、CTGF、ⅣCol、FN的基因表达及TGF-β1、CTGF、ⅣCol、LN蛋白分泌，且优于其它浓度组，提示大黄游离蒽醌抑制大鼠肾小球系膜细胞增殖、下调相关基因表达进而减少基质蛋白的分泌可能是其防治DN的作用机制之一。
大黄;化学组分;肾小球系膜细胞;药理活性
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
药理学
印晓星;魏群利
2013
中文
R269;R692;R285
78
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）