HBX在TRAIL诱导肝癌细胞凋亡中的作用研究
目的：探讨乙型肝炎病毒X基因(hepatitis B virus X gene，HBX)促TRAIL诱导肝癌细胞凋亡作用及其机制，为揭示HBX的致病机制提供实验依据。 方法：(1)克隆人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor relatedapoptosis inducing ligand，TRAIL)基因片段并克隆入原核表达载体pET30a(+)，构建重组质粒pET30a(+)/TRAIL，经测序正确后，将重组质粒转入大肠杆菌进行表达，优化蛋白表达条件，提取并纯化His-TRAIL蛋白，鉴定其生物学活性。(2)培养Huh7、Huh7-3.1、Huh7-HBX细胞，将3000ng/ml His-TRAIL作用于各组细胞48h后，采用CCK8、流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况;免疫荧光、Western blot检测细胞死亡受体DR4和DR5表达的变化;分光亮度法检测细胞caspase8、caspase3活性的变化。(3)收集临床病人肝癌标本（HBV阳性及HBV阴性），免疫组织化学检测HBX、DR4和DR5的表达，观察HBX对DR4、DR5表达的影响。 结果：(1)成功构建重组质粒pET30a(+)/TRAIL，诱导表达后收集的TRAIL蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot结果显示为可溶性的His-TRAIL，镍离子亲和层析柱分离纯化获得目的蛋白。CCK8结果显示His-TRAIL蛋白对肝癌细胞具有促凋亡作用而对正常肝细胞无细胞毒作用。(2) CCK8结果显示，Huh7-HBX组的细胞增殖情况与Huh7-3.1组和Huh7细胞相比均显着降低(P＜0.05）;流式细胞术检测结果显示，Huh7-HBX组的细胞凋亡率较Huh7-3.1和Huh7组细胞均显着提高(P＜0.05）;免疫荧光、Western blot证实HBx蛋白能够提高Huh7细胞死亡受体(death receptor) DR4、DR5的表达量;caspase活性检测结果显示，在His-TRAIL的作用下，HBX能显着提高Huh7细胞caspase8、caspase3的活性（P＜0.05）。(3)临床肝癌标本免疫组织化学显示HBV感染的病人有HBx的表达，并且在有HBx表达的肝癌组织中DR4、DR5的表达有所增加。 结论：(1)成功构建表达可溶性、具有生物学活性的TRAIL蛋白原核表达载体pET30a(+)/TRAIL。(2) HBX能够促进TRAIL诱导Huh7细胞的凋亡，其机制可能与上调细胞DR4、DR5的表达从而激活死亡受体通路有关。
乙型肝炎病毒;肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体;细胞凋亡;肝癌;致病机制
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
病原生物学
汤仁仙
2013
中文
R512.62
76
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）