HBX在TRAIL诱导肝癌细胞凋亡中的作用研究
目的:探讨乙型肝炎病毒X基因(hepatitis B virus X gene,HBX)促TRAIL诱导肝癌细胞凋亡作用及其机制,为揭示HBX的致病机制提供实验依据。 方法:(1)克隆人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor relatedapoptosis inducing ligand,TRAIL)基因片段并克隆入原核表达载体pET30a(+),构建重组质粒pET30a(+)/TRAIL,经测序正确后,将重组质粒转入大肠杆菌进行表达,优化蛋白表达条件,提取并纯化His-TRAIL蛋白,鉴定其生物学活性。(2)培养Huh7、Huh7-3.1、Huh7-HBX细胞,将3000ng/ml His-TRAIL作用于各组细胞48h后,采用CCK8、流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况;免疫荧光、Western blot检测细胞死亡受体DR4和DR5表达的变化;分光亮度法检测细胞caspase8、caspase3活性的变化。(3)收集临床病人肝癌标本(HBV阳性及HBV阴性),免疫组织化学检测HBX、DR4和DR5的表达,观察HBX对DR4、DR5表达的影响。 结果:(1)成功构建重组质粒pET30a(+)/TRAIL,诱导表达后收集的TRAIL蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot结果显示为可溶性的His-TRAIL,镍离子亲和层析柱分离纯化获得目的蛋白。CCK8结果显示His-TRAIL蛋白对肝癌细胞具有促凋亡作用而对正常肝细胞无细胞毒作用。(2) CCK8结果显示,Huh7-HBX组的细胞增殖情况与Huh7-3.1组和Huh7细胞相比均显着降低(P<0.05);流式细胞术检测结果显示,Huh7-HBX组的细胞凋亡率较Huh7-3.1和Huh7组细胞均显着提高(P<0.05);免疫荧光、Western blot证实HBx蛋白能够提高Huh7细胞死亡受体(death receptor) DR4、DR5的表达量;caspase活性检测结果显示,在His-TRAIL的作用下,HBX能显着提高Huh7细胞caspase8、caspase3的活性(P<0.05)。(3)临床肝癌标本免疫组织化学显示HBV感染的病人有HBx的表达,并且在有HBx表达的肝癌组织中DR4、DR5的表达有所增加。 结论:(1)成功构建表达可溶性、具有生物学活性的TRAIL蛋白原核表达载体pET30a(+)/TRAIL。(2) HBX能够促进TRAIL诱导Huh7细胞的凋亡,其机制可能与上调细胞DR4、DR5的表达从而激活死亡受体通路有关。
乙型肝炎病毒;肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体;细胞凋亡;肝癌;致病机制
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
病原生物学
汤仁仙
2013
中文
R512.62
76
2014-02-25(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)