刚地弓形虫苹果酸脱氢酶基因的生物信息学分析、克隆表达及免疫保护性研究
目的:对刚地弓形虫苹果酸脱氢酶(TgMDH)基因进行生物信息学分析，并对该基因进行克隆和表达，纯化表达产物，分析其免疫原性;观察重组弓形虫苹果酸脱氢酶蛋白(rTgMDH)免疫小鼠诱导的黏膜及系统免疫应答及其抗弓形虫感染作用，探讨rTgMDH作为弓形虫疫苗候选抗原的可能性。 方法:(1)对TgMDH基因的主要特性及抗原表位进行生物信息学分析。利用蛋白分析专家(ExPASy)提供的ProtParam、SOSUI、TMPRED、HNN、MotifScan,NCBI上的ORF finder、Bcepred等生物信息学在线分析程序，结合Gene Runner、DNAMAN等生物信息学软件，分析、预测TgMDH蛋白的理化性质、可溶性、表面可及性、可塑性跨膜区翻译后修饰位点、亲（疏）水性、二级结构、抗原表位，通过SWISS-MODLE软件预测该蛋白的三维结构。(2)构建重组质粒pET30a(+)-TgMDH，并在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白。对原核表达的rTgMDH进行纯化及免疫原性分析。收集、纯化RH株弓形虫速殖子，提取总RNA;设计合成引物并引入EcoRI和Xho I酶切位点，RT-PCR扩增编码TgMDH的基因片段克隆到原核表达载体pET30a(+)中，用双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆。在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达，以SDS-PAGE鉴定表达产物。以镍离子亲和层析柱对大量表达的rTgMDH进行纯化，以小鼠抗rTgMDH血清和兔抗弓形虫血清作为一抗，经Western blot分析其抗原性。(3)观察不同剂量rTgMDH滴鼻免疫小鼠诱导的黏膜和系统免疫应答。BALB/c小鼠40只随机分为5组，分别用10μg、20μg、30μg、40μg rTgMDH/只滴鼻免疫BALB/c小鼠，免疫3次，一免与二免间隔14d，二免与三免间隔7d。rTgMDH溶于20μlPBS中，对照组用等量PBS滴鼻。末次免疫后14d，摘眼球采血，分离血清，采集小肠、鼻咽和膀胱冲洗液。ELISA法测定上述3种冲洗液中抗rTgMDH sIgA和IgG及血清中抗rTgMDHIgA和IgG。分离脾淋巴细胞并培养，ELISA法测定培养24h脾淋巴细胞培养液上清中IL-2、IL-4、IL-10和培养96h培养液上清中IFN-γ。(4)观察30μg rTgMDH滴鼻免疫小鼠诱导的抗弓形虫感染作用。BALB/c小鼠60只，随机分为免疫组和对照组，每组30只。各组内慢性感染小鼠8只，急性感染小鼠22只。用30μgrTgMDH溶于20μl PBS中滴鼻免疫对照组小鼠3次，对照组用等量PBS滴鼻。末次免疫后第14d，分别用8×104速殖子/只和9×105速殖子/只灌胃感染小鼠，观察慢性感染和急性感染时小鼠的健康及存活状况。攻击感染后一个月，计数小鼠肝、脑组织内弓形虫速殖子数。 结果:(1)生物信息学分析发现，刚地弓形虫MDH有9个表面可及性参数≥1.9的区域、4个亲水性参数≥1.9的区域、7个柔韧性参数≥2的区域、14个翻译后修饰位点、14个潜在抗原表位，可能具有免疫原性。(2)以RH株弓形虫速殖子的cDNA为模板，扩增获得951 bp的TgMDH基因片段，并成功构建重组质粒pET30a(+)-TgMDH; IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明，目的基因在大肠杆菌BL21中高效表达，相对分子量约36 kDa。Western blot显示，纯化后的rTgMDH能被小鼠抗rTgMDH血清和兔抗弓形虫血清识别，具有抗原性。(3)不同剂量rTgMDH滴鼻免疫小鼠，均不同程度诱导了小鼠特异性免疫应答。与对照组相比，免疫组小鼠的血清sIgA及鼻咽冲洗液、膀胱冲洗液和小肠冲洗液IgA水平高于对照组，具有统计学意义(F=12.773，P＜0.01; F=33.41，P＜0.01;F=9.289,P＜0.01;F=5.877，P＜0.01);免疫小鼠的IgG水平高于对照组，其中血清、鼻咽冲洗液和膀胱冲洗液IgG水平差异具有统计学意义(F=6.935，P＜0.01; F=28.386，P＜0.01;F=8.061，P＜0.01)，尤以30μg、40μg组显著。各免疫组小肠冲洗液IgG水平与对照组相比均无无统计学意义。免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清细胞因子增加，与对照组相比，差异均具有统计学意义(IL-2;F=43.967，P＜0.01;IL4:F=7.28,P＜0.01;IL-10:F=12.91，P＜0.01)，尤以30μg组显著。免疫组IFN-γ水平增高，与对照组相比，也具统计学意义(F=3.063，P＜0.05)，尤以30μg、40μg组显著。30μg组可以更有效地诱导黏膜和系统免疫应答。(4)经30μg rTgMDH滴鼻免疫的小鼠在攻击感染后第7天，出现竖毛、倦怠、活动减少、饮水及采食减少。在急性感染组，免疫小鼠的存活率为52.38％，对照组存活率为31.82％，慢性感染小鼠则全部存活。免疫组小鼠肝组织内虫荷（速殖子数）低于对照组（F=24.98，F=46.249，P＜0.01）。 结论:(1)生物信息学分析发现刚地弓形虫MDH有14个潜在的抗原表位，可能具有免疫原性。(2)成功构建重组质粒pET30a(+)-TgMDH，并在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白。原核系统表达的rTgMDH具有免疫抗原性。(3)作为弓形虫疫苗的候选抗原，30μg rTgMDH滴鼻免疫更有效诱导了黏膜和系统免疫应答，对抗弓形虫感染具有一定保护作用。
刚地弓形虫;苹果酸脱氢酶基因;生物信息学;克隆表达;免疫保护性
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
病原生物学
刘宜升
2013
中文
R382.5
84
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）