转染Akt1基因对缺氧复氧乳鼠心肌细胞的抗凋亡作用及机制研究
目的：通过重组慢病毒表达载体携带蛋白激酶B(Akt1)基因感染乳鼠心肌细胞，将心肌细胞缺氧复氧模拟缺血再灌注损伤，探讨Akt1基因对心肌细胞缺血再灌注损伤的抗凋亡作用及此作用与钠钙交换蛋白1(NCX1)的关系。 方法：1.采用本实验室前期方法分离和培养乳鼠原代心肌细胞，并进行目的基因转染，利用表达载体pLVX-EGFP-3FLAG中带有的EGFP报告基因，对感染效率进行监测。2.建立心肌细胞缺氧复氧模型模拟心肌缺血再灌注损伤，通过MTT和TUNEL法检测转染Akt1基因对缺氧复氧乳鼠心肌细胞的保护作用。3.通过RT-PCR和Western blot检测Akt1与NCX1的关系。实验方法分组如下:首先分五组:①正常对照组（C组）;②缺氧复氧组(HR组）;③空载体组(CV组);④Akt1基因转染组（A组）;⑤Akt1抑制剂LY294002组（LY组），通过MTT法检测心肌细胞活性，TUNEL法检测心肌细胞的凋亡来验证Akt1对心肌细胞的保护作用。然后外加两组:⑥NCX1逆向转运模式抑制剂KB-R7943组(K组）;⑦基因转染+KB-R7943组（A+K组），使用RT-PCR检测Akt1和NCX1的mRNA水平变化，Western blot检测Akt1、P-Akt1、NCX1及线粒体凋亡途径相关凋亡蛋白细胞色素C和caspase-9蛋白的表达。 结果：1.培养出纯度＞95％的乳鼠心肌细胞，向心肌细胞转染重组慢病毒LV-Akt1，24h心肌细胞绿色荧光表达明显增强，至48h荧光表达率及强度稳定，检测慢病毒LV-Akt1的最佳感染复数(MOI)为25。2.MTT及TUNEL检测结果显示:与C组相比，HR组心肌细胞活力明显降低，凋亡率增高(p＜0.05)，但转染Akt1后（A组）可以增加心肌细胞活力和降低心肌细胞凋亡率(p＜0.05)。LY组与CV组对缺氧复氧心肌细胞活力及凋亡率无明显影响(p＞0.05)。3.RT-PCR及Western blot检测结果显示:与C组相比，HR组心肌细胞Akt1和NCX1的mRNA水平及蛋白水平都无明显改变(p＞0.05)，凋亡蛋白的量明显增加(p＜0.05)。但转染Akt1基因后（A组），Akt1的mRNA水平和蛋白水平升高(p＜0.05)，NCX1mRNA水平和蛋白水平反而是降低的(p＜0.05)，同时凋亡蛋白的量也有所下降(p＜0.05).LY组和CV组与HR组相比对二者mRNA水平和蛋白水平都无明显影响(p＞0.05)，LY组可以降低缺氧复氧时P-Akt1蛋白表达(p＜0.05)，但对凋亡蛋白影响不大(p＞0.05)。分别转染Akt1(A组)和加入KB-R7943（K组）相比对凋亡蛋白影响没有明显差别，但二者联合干预（A+K组）可以使凋亡蛋白的量降的更低(p＜0.05)。 结论：慢病毒载体转染Akt1基因，能对缺氧复氧的乳鼠心肌细胞起抗凋亡作用，而且这种作用部分与抑制NCX1的表达有关，使得线粒体途径凋亡相关蛋白量减少，达到抑制凋亡的作用。
心肌细胞缺血再灌注损伤;Akt1基因;抗凋亡作用;钠钙交换蛋白1;慢病毒载体
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
内科学(心血管病)
李东野
2013
中文
R541.402
64
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）