损伤脊髓匀浆上清液对脑脊液诱导的大鼠骨髓源性神经前体细胞分泌功能的影响
目的：通过观察脑脊液诱导大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)定向分化为神经前体细胞(neural precursor cells，NPCs)的情况，进一步完善脑脊液诱导BMSCs定向分化为NPCs的方法学。通过观察损伤脊髓匀浆上清液共培养对脑脊液诱导的骨髓源性神经前体细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells-derived neural precursor cells,BMSC-Ns)增殖、分化的影响，以及分化产生的神经细胞分泌脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophic factor，BDNF)和产生髓鞘前脂蛋白(myelin proteolipid protein，PLP)的功能，为脑脊液诱导的BMSC-Ns修复脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)提供依据。 方法：全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs，传至第3代，用免疫组化法检测细胞CD34、CD44、CD71的表达，计算阳性细胞率。取第3代BMSCs，随机分为脑脊液诱导组和生长因子诱导组，分别采用100％成人脑脊液、含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和10μg/L表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)的DMEM/F12培养基诱导培养。4d后每组再随机分为2组，吸去培养液，分别加入正常大鼠、SCI大鼠的脊髓匀浆上清液共培养21d。在各时间点倒置显微镜下观察细胞形态，手持式自动细胞计数器检测活细胞数量，免疫组化法检测细胞巢蛋白(Nestin)、胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillaryacidic protein，GFAP)、微管相关蛋白-2（microtubule associated protein-2，MAP-2）的表达，计算阳性细胞率。在各时间点采用ELISA法检测细胞培养液内BDNF和PLP的浓度。 结果：全骨髓贴壁法分离培养的SD大鼠BMSCs表达CD44、CD71，不表达CD34。BMSCs经脑脊液、生长因子诱导4d后大部分表达Nestin，少量表达GFAP、MAP-2，脑脊液诱导组表达Nestin、GFAP、MAP-2的阳性细胞率高于生长因子诱导组表达Nestin、GFAP、MAP-2的阳性细胞率(P＜0.05)。诱导后的BMSCs分别与正常脊髓匀浆上清液、损伤脊髓匀浆上清液共培养后，随着时间的延长，倒置显微镜下观察到细胞突起渐渐增多，伸出较长的伪足、相互交织，类似于树突、轴突样结构的神经细胞和星状胶质细胞，21d时脑脊液诱导的BMSC-Ns仅有少量细胞脱落、死亡，而生长因子诱导的BMSC-Ns出现大量细胞脱落、死亡。与损伤脊髓匀浆上清液共培养21d后，脑脊液诱导的BMSC-Ns活细胞数量为1.73×105±0.06×105，明显多于生长因子诱导的BMSC-Ns活细胞数量，少于正常脊髓匀浆上清液共培养的BMSC-Ns活细胞数量(P＜0.05)。共培养21d后，各组表达MAP-2的阳性细胞率明显高于表达GFAP的阳性细胞率(P＜0.05)。脑脊液诱导的BMSC-Ns表达GFAP、MAP-2的阳性细胞率均高于生长因子诱导的BMSC-Ns表达GFAP、MAP-2的阳性细胞率(P＜0.05)。损伤脊髓匀浆上清液共培养的BMSC-Ns表达GFAP、MAP-2的阳性细胞率均高于正常脊髓匀浆上清液共培养的BMSC-Ns表达GFAP、MAP-2的阳性细胞率(P＜0.05）。与脊髓匀浆上清液共培养后，随着时间的延长，各组细胞培养液内BDNF、PLP浓度起初均逐渐下降，6d后逐渐增高。9d后生长因子诱导的BMSC-Ns培养液内BDNF、PLP的浓度逐渐下降，脑脊液诱导的BMSC-Ns培养液内BDNF、PLP的浓度无下降趋势。脑脊液诱导的BMSC-Ns培养液内BDNF、PLP的浓度在3d、6d、9d、12d、15d、18d、21d均高于生长因子诱导的BMSC-Ns培养液内BDNF、PLP的浓度(P＜0.05)。损伤脊髓匀浆上清液共培养的BMSC-Ns培养液内BDNF、PLP水平在各个时间点均高于正常脊髓匀浆上清液共培养的BMSC-Ns培养液内BDNF、PLP的浓度(P＜0.05）。 结论：脑脊液可诱导BMSCs定向分化为NPCs，分化产生的NPCs比例高于细胞生长因子诱导法。在损伤脊髓匀浆上清液中脑脊液诱导的BMSC-Ns主要向神经元方向分化，分化产生的神经元细胞数量、存活时间，分化产生的神经细胞分泌BDNF和产生PLP的能力明显优于细胞生长因子诱导的BMSC-Ns。与正常脊髓匀浆上清液比较，在损伤脊髓匀浆上清液中BMSC-Ns分化产生的神经细胞分泌BDNF和产生PLP的能力明显增强。
脊髓损伤;骨髓源性神经前体细胞;分泌功能;匀浆上清液
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
急诊医学
叶英;许铁
2013
中文
R651.2
55
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）