慢病毒介导shRNA靶向沉默VEGF-A乳腺癌细胞株的构建
目的：通过构建血管内皮生长因子VEGF-A基因RNA干扰慢病毒载体，介导其对VEGF-A基因沉默，筛选并建立VEGF-A基因稳定下调的乳腺癌细胞株。 方法：1.设计三对靶向VEGF-A的shRNA表达序列并连接到慢病毒转移质粒pLB中，成功构建pLB-VEGF-A/shRNA质粒，并经PCR和测序鉴定;2.分别将构建的重组质粒与慢病毒包装质粒pCMVA8.91、被膜蛋白质粒pMD.G通过lipofectamine2000共转染至包装细胞293FT细胞，生产慢病毒颗粒，同时利用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达水平来检测其滴度;3.包装产生慢病毒后感染乳腺癌细胞株MCF-7，经流式细胞仪分选出GFP阳性细胞，并收集培养;4.实时荧光定量RT-PCR对VEGF-A在mRNA水平上的沉默效果进行鉴定，并筛选出沉默效果最佳的干扰序列。 结果：1.PCR扩增和测序验证重组质粒pLB-VEGF-A/shRNA1，2，3构建成功;2.重组质粒同另两种包装质粒共转染293FT细胞后生产出的慢病毒颗粒滴度达108IU/ml;3.慢病毒颗粒分别感染MCF-7细胞，与空白对照组相比，三组特异性干扰组感染MCF-7细胞VEGF-A mRNA的表达量均下降，分别降低了(43.42±0.03)％、(68.18±0.02)％、(81.85±0.03)％，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中pLB-VEGF-A/shRNA3组VEGF-A基因沉默效果最明显，表达量下降了(81.85±0.03)％;而阴性对照组与空白对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。 结论：1.成功地构建了携带人VEGF-A基因的慢病毒表达载体;2.成功地筛选出高效VEGF-A/shRNA干扰序列，并且构建了VEGF-A基因稳定下调的乳腺癌工程细胞株MCF-7。
乳腺癌;血管内皮生长因子A;RNA干扰;慢病毒载体
徐州医科大学;徐州医学院
硕士
肿瘤学
杜秀平;韩正祥
2013
中文
R737.9;R730.23
60
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）