一株抗肿瘤新城疫病毒的全基因组测序及毒力测定
新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)为单负链不分节段的RNA病毒，属于副黏病毒属。近些年来，NDV的宿主范围不断扩大，可感染多种家禽和野生鸟类，引发新城疫(newcastle disease，ND)，而人类对NDV的感染率极低，主要表现为流感样症状。NDV对肿瘤细胞的特异性杀伤能力已经使其成为抗肿瘤生物制剂的研究热点。目前，越来越多的NDV株已被证明能够高效抗肿瘤，而对于同一种肿瘤细胞，不同NDV株的杀伤能力却不同，这可能与病毒间的基因组序列差异密切相关。同时，NDV的抗肿瘤机制研究越来越需要将病毒基因组序列与NDV诱导的肿瘤细胞凋亡信号通路联系起来。本实验室保存一株抗肿瘤NDV——HBNU/LSRC/F3，其抗肿瘤机制已被初步探索，本实验将测定HBNU/LSRC/F3的毒力及其全基因组序列。 在毒力测定部分，首先制备NDV HBNU/LSRC/F3和Mukteswar，之后设立空白对照组、阴性对照组（灭菌生理盐水）、阳性对照组(Mukteswar)及实验组，最后测定鸡胚平均致死时间(mean death timeof chick-embryos，MDT)、脑内致病指数(intracerebral pathogenicityindex，ICPI)及静脉致病指数(intravenous pathogenicity index，IVPI)。在全基因组测序部分，首先通过试剂盒提取病毒基因组RNA，之后利用设计的16对引物通过一步法RT-PCR及两步法RT-PCR进行目的片段的扩增，扩增片段之间部分重叠，且拼接后覆盖整个基因组。对于基因组的两末端，采用锚定引物及特异性引物，通过简化的cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA end，RACE）而获取相应的扩增片段。所有扩增片段在电泳鉴定后被送往北京华大公司进行纯化后测序，并通过生物信息学软件处理测序结果和进行序列分析。 结果显示HBNU/LSRC/F3的MDT为105.6 h，ICPI为0.26，IVPI为0，这些致病指数均在弱毒株范围内，故HBNU/LSRC/F3为弱毒株。但经序列对比及分析后发现，HBNU/LSRC/F3 F蛋白的裂解位点具有强毒株的特征性结构，即112RRQRR↓F117，因此HBNU/LSRC/F3为F蛋白具有强毒株裂解位点的NDV弱毒株，可被归为不遵循一般规则的特殊NDV，其毒力必然与除F蛋白裂解位点之外的其他因素密切相关。 HBNU/LSRC/F3基因组全长为15192 nt，其中蛋白编码序列含量为90.5％，G+C mol％为46.8％。整个基因组包括3'末端(55 nt)、NP基因(1753 nt)、P基因(1451 nt)、M基因(1241 nt)、F基因(1792nt)、HN基因(2002 nt)、L基因(6703 nt)和5'末端(114 nt)。6个基因的编码蛋白为NP蛋白(489 aa)、P蛋白(395 aa)、V蛋白(239 aa)、W蛋白(137 aa)、M蛋白(364 aa)、F蛋白(553 aa)、HN蛋白(571aa)及L蛋白(2204 aa)。绘制的各个系统进化树表明HBNU/LSRC/F3属于ClassⅡ谱系的基因Ⅸ型，基因Ⅸ型与基因Ⅲ型的亲缘关系最近。HBNU/LSRC/F3与典型NDV株比较，与F48E8的序列相似性最高。 本实验通过传统毒力测定方法、分子生物学技术及生物信息学软件对HBNU/LSRC/F3的毒力及全基因组序列进行了测定和初步分析，旨在为后续充分了解HBNU/LSRC/F3的抗瘤机制及提高其溶瘤特性提供相关依据。
新城疫病毒;毒力测定;基因组测序;系统进化树;序列相似性;抗肿瘤机制
河北北方学院
硕士
病原生物学
刘开扬
2013
中文
Q939.92;R979.1
87
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）