肝豆状核变性遗传和致病机制研究
肝豆状核变性家系ATP7B基因突变筛查和单体型分析 目的:1.检测2010年9月至2012年12月间中南大学湘雅三医院就诊的9个中国汉族肝豆状核变性(Wilson's disease，WD)患者及家系的ATP7B基因突变类型及突变频率，并进行单体型分析。2.分析肝豆状核变性患者临床特点，鉴定基因型和表型之间的关系。 方法:应用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)和基因测序法，检测9个肝豆状核变性患者、部分家系成员及正常对照的ATP7B基因突变情况。 结果:1.9个WD家系中发现1个纯合子ATP7B基因突变家系和8个复合杂合子ATP7B基因突变家系。总共有11种突变类型，包括1个无义突变(p.Ser105X)、1个移码突变(c.1708-1G＞C)和9个错义突变(p.Arg778Leu、p.Pro840Leu、p.Ala874Pro、p.Thr888Pro、p.Thr935Met、 p.Pro992Leu、 p.Asp1047Val、 p.Ile1148Thr和p.Glu1173Lys)，但9例WD患者中未发现新突变。同时在ATP7B基因突变检测过程中发现有8种多态，包括p.Ile390Val、p.Ser406Ala、p.Va1456Leu、p.Leu770Leu、p.Arg832Lys、p.Arg952Lys、p.Val1140Ala和IVS18+6T/C。2.共同疾病单体型分析结果发现M1841家系和M4056家系存在共同疾病单体型;M1841家系、M1856家系、M4061家系、M4062家系和M4174家系存在共同疾病单体型;M1807家系和M1856家系存在共同疾病单体型。联合前期试验结果，提示湖南地区WD家系可能存在奠基者效应。3.9个家系ATP7B基因突变检测所发现的11种突变类型中，p.Ala874Pro和p.Thr888Pro两个突变均位于11号外显子中;p.Ile1148Thr和p.Glu1173Lys两个突变均位于16号外显子中。2例患者均存在外显子8的p.Arg778Leu突变，5例患者均存在外显子13的p.Pro992Leu突变，2例患者均存在外显子16的p.Ile1148Thr突变，基因突变频率分别为11.1％，27.8％和16.7％。因此，我们认为外显子8、11、13和16可作为肝豆状核变性的优先筛查区域。4.9例WD患者的临床分析结果显示6例脑型患者发病年龄为20.7±10.9，而3例肝型患者发病年龄为22.7±15.3，肝型患者的发病年龄相比于脑型患者无明显下降(p＞0.05)。脑型患者至我院就诊时均合并肝脏症状，均有锥体外系症状，占100％(6/6)。肝硬化、脾大、腹水和黄疸为WD患者常见肝脏症状。所有患者中均发现K-F环和血清铜蓝蛋白(serum ceruloplasmin，CP)降低(＜0.2g/L)以及ATP7B基因突变，提示以上3项检查对于WD诊断具有重要意义。 结论:1.我们所筛查的9个家系中均发现ATP7B基因突变，共有11种突变类型和8种多态。2.单体型分析发现M1841家系和M4056家系存在共同疾病单体型;M1841家系、M1856家系、M4061家系、M4062家系和M4174家系存在共同疾病单体型;M1807家系和M1856存在共同疾病单体型;提示以上家系可能存在奠基者效应。3.外显子8、11、13和16可作为是湖南地区肝豆状核变性的优先筛查区域。 ATP7B siRNA干扰对HepG2细胞活性、凋亡及下游蛋白的影响 目的:通过将ATP7B siRNA转染到HepG2细胞，达到干扰HepG2细胞中的ATP7B基因表达的目的，构建肝豆状核变性肝细胞模型，并分析ATP7B基因沉默后细胞活性变化和凋亡变化情况，以及凋亡相关基因BCL2和BAX、脂肪代谢通路相关基因SREBP1和细胞增生相关基因MCM7四种基因及蛋白表达情况的变化，探索可能的致病机制。 方法:1.米用siRNA干扰的方法，将目标序列为:5'-CCAATTGATATTGAGCGGTTA-3'的ATP7B siRNA以及AllStarsNegative Control siRNA分别干扰HepG2细胞后，利用RT-PCR方法检测实验组和对照组中ATP7B基因表达的变化，利用Western blot法检测实验组和对照组中ATP7B蛋白表达的变化，确定最佳ATP7BsiRNA干扰浓度和转染时间。2.采用MTT法检测AllStars NegativeControl siRNA干扰组和ATP7B siRNA干扰组HepG2细胞在0μM、50μM和200μM三种不同浓度硫酸铜作用后的细胞活性变化。3.采用凋亡染色和电镜观察法检测AllStars Negative Control siRNA干扰组、ATP7B siRNA干扰组、200μM硫酸铜诱导组和ATP7B siRNA干扰+200μM硫酸铜诱导组作用HepG2细胞后4组细胞凋亡变化情况。4.采用RT-PCR和Western blot法分别检测BCL2、BAX、SREBP1和MCM7四种基因表达和蛋白水平的变化情况。 结果:1.相比AllStars Negative Control siRNA干扰的HepG2细胞，5nM ATP7B siRNA干扰HepG2细胞24h，48h和72h后，ATP7B基因的表达明显下降达86.3％，93.1％和90.8％(P＜0.01)，蛋白表达分别下降58.5％，85.5％和82.1％(P＜0.01)，其中5nM ATP7B siRNA干扰48小时可达最大干扰效率。2.未处理组、AllStars NegativeControl siRNA干扰组和ATP7B siRNA干扰组分别经50μM硫酸铜处理和200μM硫酸铜处理后，HepG2细胞活力均随着铜浓度的增高比单独AllStars Negative Control siRNA干扰组分别下降53.3％和79.8％(均P＜0.05)，相比单独ATP7B siRNA干扰组细胞活力分别下降44.0％和77.6％(均P＜0.05)。ATP7B siRNA+200μM硫酸铜组相比较 AllStars Negative Control siRNA+200μM硫酸铜组和单独200μM硫酸铜组细胞活力无明显变化(p＞0.05)。3.ATP7B siRNA单独处理组约有10.6％细胞发生凋亡，较AllStars Negative Control siRNA干扰组有显著增加(P＜0.05);200μM硫酸铜组细胞凋亡数增加至18.3％，较AllStars Negative Control siRNA干扰组有显著增加(P＜0.05);ATP7B siRNA+200μM硫酸铜组细胞凋亡数增加至24.6％，较ATP7BsiRNA单独处理组和200μM硫酸铜单独处理组有明显差异(P＜0.05)。4.Real time RT-PCR结果表明ATP7B siRNA干扰组中BCL2mRNA较AllStars Negative Control siRNA干扰组在24h，48h和72h分别降低90.8％，95.4％和96.1％(均P＜0.05)，而BAX mRNA表达较AllStars Negative Control siRNA干扰组在24h，48h和72h分别增加5.9-fold,6.4-fold和7.2-fold(均P＜0.05);SREBP1 mRNA在ATP7BsiRNA干扰组中较AllStars Negative Control siRNA干扰组在24h，48h和72h分别降低49.7％，59.9％和80.0％(均P＜0.05);MCM7 mRNA在ATP7B siRNA干扰组中较AllStars Negative Control siRNA干扰组在24h，48h和72h分别降低89.2％，95.1％和95.5％(均P＜0.05)。5.BCL2蛋白表达在ATP7B siRNA干扰24h组，48h组和72h组中较同时间AllStars Negative Control siRNA干扰组分别下调54.6％，19.3％和3.1％(均P＜0.05)，而BAX蛋白表达在ATP7B siRNA干扰24h组，48h组和72h组中较AllStars Negative Control siRNA干扰组分别上调1.8倍，1.7倍和3.2倍(均P＜0.05); SREBP1蛋白表达在ATP7B siRNA干扰24h组，48h组和72h组中较同时间AllStars Negative ControlsiRNA干扰组分别下调42.7％，52.2％和94.9％(均P＜0.05);MCM7蛋白表达在ATP7B siRNA干扰24h组，48h组和72h组中较同时间AllStars Negative Control siRNA干扰组分别下调32.8％，92.4％和93.6％(均P＜0.05)。 结论:1.目标序列为:5'-CCAATTGATATTGAGCGGTTA-3'的ATP7B siRNA干扰可以有效抑制HepG2细胞内ATP7B mRNA和蛋白的表达，可成功构建肝豆状核变性肝细胞模型。2.铜毒性呈剂量依赖关系，铜可以诱导ATP7B siRNA干扰后的细胞活力下降。3.ATP7BsiRNA干扰和高铜对肝细胞有促调亡作用。4.ATP7B siRNA干扰组相比AllStars Negative Control siRNA干扰组HepG2细胞的BCL2、BAX、SREBP1和MCM7四种基因表达和蛋白水平均有明显变化。
肝豆状核变性遗传;致病机制;基因突变筛查;单体型分析;聚合酶链式反应
中南大学
博士
临床医学
邓昊
2013
中文
R742.4
111
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）