GRIN2B shRNA的构建及其对小鼠NR2B基因沉默效果的实验研究
目的: 1.设计并构建小鼠NMDA受体NR2B亚基短发卡RNA干扰真核表达载体（GRIN2B shRNA）并鉴定。 2.通过鞘内转染聚乙烯亚胺(PEI)介导的GRIN2B shRNA干扰质粒，研究该干扰质粒对小鼠NR2B基因表达的影响，探讨GRIN2BshRNA干扰质粒用于慢性疼痛治疗的可行性。 方法: 1.根据NMDA受体NR2B亚基mRNA编码序列，设计并合成针对NR2B亚基的特异性RNA干涉片断，将其克隆入pYr-1.1质粒载体，构建NR2B亚基shRNA真核表达载体pYr-1.1-GRIN2B-shRNA，并对其进行酶切和测序鉴定。 2.选用成年雄性C57BL/6小鼠60只，随机分为4组:正常组、生理盐水组、阴性对照组和PEI-shRNA组。于鞘内注射后第7天在小鼠足底皮下注射50μL1％的福尔马林后对其进行疼痛行为学观察，并且取小鼠腰段脊髓分别行RT-PCR、Western Blot检测及免疫组化分析，观察小鼠脊髓NR2B mRNA、蛋白的表达水平及定位。 结果: 1.酶切和测序结果均证明NMDA受体NR2B亚基短发卡RNA已经插入到质粒载体pYr-1.1里。 2.疼痛行为学观察显示:福尔马林所致的Ⅰ相期（急性期）的伤害性反应，在各组中均无差别(p＞0.05);与正常组、生理盐水(NS)组、阴性对照(Scr)组相比，PEI-shRNA组Ⅱ相期（强直期）的伤害性反应显著减少(p＜0.05)，而正常组、生理盐水组和阴性对照组比较，无显著性差异(p＞0.05)。 3.PCR及Western Blot检测小鼠脊髓NR2B mRNA及蛋白的表达显示:与正常组、NS组和Scr组相比，PEI-shRNA组小鼠L4-6段脊髓的NR2B mRNA及蛋白表达水平明显降低(p＜0.05)，而正常组、生NS组和Scr组比较，无显著性差异(p＞0.05)。 4.免疫组化结果显示:NR2B主要在小鼠L4-6段脊髓背角浅层表达;与正常组、NS组和Scr组相比，PEI-shRNA组小鼠L4-6段脊髓NR2B阳性的细胞数明显减少(p＜0.05)，而正常组、NS组和Scr组比较，无显著性差异(p＞0.05)。 结论: 1.pYr-1.1-GRIN2B-shRNA干扰质粒构建成功，为后续NR2B作为镇痛靶点的基因治疗奠定了基础。 2.PEI介导的GRIN2B shRNA干扰质粒能够使小鼠脊髓NR2B的表达明显下调。 3.PEI介导的GRIN2B shRNA干扰质粒能够减轻福尔马林引起的Ⅱ相炎性痛，进一步证明NR2B在疼痛的维持与中枢敏化中起重要作用，为疼痛治疗提供了新的方法和思路。
NR2B亚基表达;短发卡RNA;基因沉默;慢性疼痛;RNA干扰;中枢敏化
中南大学
硕士
临床医学
黄东
2013
中文
R441.1;R457.2
53
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）