MIPU1对阿霉素所致HEK293细胞凋亡的保护作用
目的:阿霉素(Doxorubicin，DOX)是临床上用于治疗肿瘤的化疗药物，但是阿霉素存在很大的毒副作用，如阿霉素心肌病，阿霉素肾病等。这些毒副作用主要和细胞凋亡有关。Mipu1是本科室发现的一个缺血预适应诱导表达上调的新基因(GenBank登录号为AY221750)，并已证实Mipu1是一种KRAB型锌指蛋白，具有转录抑制作用。通过生物信息学比对，发现Mipu1结构上十分保守，在啮类动物和人之间具有相当高的同源性。同时发现凋亡相关基因Bax、Bcl-2、P53、Bid、Bak等的启动子区含有Mipu1的核心结合位点。然而，Mipu1是否可以在转录水平调节上述凋亡相关基因表达，从而减轻DOX的细胞毒性作用并不清楚。因此，本研究拟在探讨MIPU1对DOX所致细胞凋亡的影响及其可能的分子机制，以期为深入阐明新基因Mipu1的生物学功能提供新的证据，为预防DOX抗肿瘤治疗过程中的毒副作用提供新的思路。 方法:本次实验以DOX诱导人胚胎肾细胞（HEK293）凋亡为模型[1]，通过瞬时转染MIPU1真核表达质粒pEGFP-MIPU1，使细胞过表达MIPU1。实验分为四组，即pEGFP组、MIPU1组、pEGFP+DOX组和MIPU1+DOX组。(1)采用MTT实验观察DOX处理下MIPU1过表达对细胞存活率的影响;(2)采用Hoechst33258染色、Caspase-3活性检测和流式细胞术分析MIPU1过表达对DOX所致细胞凋亡的影响;(3)采用Western blot和RT-PCR分析MIPU1过表达对DOX所致抗凋亡基因Bcl-2、促凋亡基因P53和Bax在蛋白和mRNA水平表达变化的影响;(5)采用双荧光素酶报告基因分析MIPU1对Bax启动子活性的影响。 结果:(1) HEK293细胞经过DOX处理后细胞存活率明显下降(p＜0.01 VS pEGFP);当转染pEGFP-MIPU1使细胞过表达MIPU1后，DOX所致的细胞死亡被明显抑制(P＜0.05 VS pEGFP+DOX)。(2)HEK293细胞经过DOX处理后细胞凋亡率明显增加(P＜0.01 VSpEGFP);过表达MIPU1则明显抑制DOX所致的细胞凋亡率的增加(P＜0.01 VS pEGFP+DOX)。(3) DOX处理HEK293细胞后，Bcl-2的表达明显减少(P＜0.05 VS pEGFP);但是过表达MIPU1后Bcl-2的表达则明显增多(P＜0.05 VS pEGFP+DOX)。(4) HEK293细胞经过DOX处理后，Bax和P53的表达明显增多(P＜0.05 VSpEGFP);过表达MIPU1后，Bax和P53的表达则明显下降(P＜0.05VS pEGFP+DOX)。(5)将含有Bax启动子的报告基因与pEGFP-MIPU1共同转染细胞后，发现荧光素酶活性明显下降，且两者呈量效关系，当Bax启动子发生突变后，则荧光素酶活性不受影响(P＜0.01 VS pEGFP)。 结论:(1) MIPU1过表达对DOX引起的HEK293细胞凋亡具有保护作用;(2)其机制可能与抑制DOX导致的Bcl-2的减少、P53和Bax的增多有关;(3)MIPU1能抑制Bax基因启动子的转录活性，其抑制作用可能依赖于MIPU1的特异性结合位点。
HEK293细胞;阿霉素;细胞凋亡;促凋亡基因;MIPU1过表达;保护作用
中南大学
硕士
基础医学
涂自智
2013
中文
R979.1;R965
70
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）