胃癌细胞CXCR1沉默前后差异蛋白的筛选与鉴定
目的:通过蛋白质组学研究，筛选和鉴定CXCR1shRNA质粒稳定转染胃癌MKN45细胞系(si-CXCR1-MKN45)与空载体稳定转染MKN45细胞系(si-Scrambled-MKN45)之间差异表达的蛋白质。 方法:首先分别建立两种稳定转染细胞系，将CXCR1 shRNA质粒和空白质粒分别转染入人源性胃癌细胞系MKN45，通过G418筛选，构建稳定低表达CXCR1蛋白的细胞系(si-CXCR1-MKN45)和对照组细胞系（si-Scrambled-MKN45）。通过real-time-PCR和Western-blotting检测转染细胞CXCR1的表达情况。然后分别抽提两组细胞的总蛋白，每组蛋白平行进行3次双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)，ImageMaster图像分析软件进行图像分析，获得这两个细胞系的蛋白裂解产物双向凝胶电泳的差异表达蛋白质图谱，选择其中具有两倍差异表达以上的蛋白质点采用反射式基质辅助激光解吸附电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)技术进行分析。并用Western-blotting方法验证了其中5个关键点蛋白质Keratin8，NDPKA，HSP27，sorcin，hnRNPK在细胞系中的表达情况。 结果:在si-CXCR1-MKN45和si-Scrambled-MKN45两组细胞系中，共识别了101个差异表达的蛋白质点，57个蛋白质点在CXCR1沉默后表达下调，30个蛋白质点表达上调，6个蛋白质点完全消失，另外出现了8个新的蛋白质点。选择其中两组细胞中具有两倍差异表达以上的29个蛋白质点进行质谱分析，成功鉴定出27种蛋白质。根据功能可以将这些差异表达蛋白分为6类:1分子伴侣2信号转导蛋白3细胞骨架蛋白4转录蛋白5钙结合蛋白6代谢相关酶类。分别为:HSP27,SET translocation,GrpE-like1,hnRNPC(C1/C2),hnRNPK,hCG2020155, clathrin light chain A, Keratin8,alanyl-tRNA synthetasevariant,importin subunit alpha-4, cardiac ventricular myosin, Alg-2,sorcin, NADH dehydrogenase, galactokinase, NDPKA,NDPKB,methylthioribose-1-phosphate isomerase,chymotrypsinogen,PMPCBprotein, phosphoserine phosphatase,KIAA0088,ATP synthase,Metaxin-2，Enoyl-Coenzyme A Hydratase。Western-blotting验证发现NDPKA，HSP27，sorcin，hnRNPK蛋白在si-CXCR1-MKN45细胞系中的表达量明显低于其在si-Scrambled-MKN45对照细胞系中的表达量，而Keratin8的表达量在si-CXCR1-MKN45细胞系中明显升高，与双向电泳技术结果相一致。 结论: 1.鉴定出27种与CXCR1相关的蛋白质，为深入研究CXCR1与胃癌的关系提供了进一步证据。 2.鉴定出的差异蛋白功能涉及凋亡增殖、信号转导、细胞粘附、细胞代谢及耐药等方面。通过对这些蛋白的进一步研究，将有助于解析CXCR1基因表达缺失对胃癌细胞影响的分子机制，从而为寻找新的胃癌敏感治疗靶点奠定基础。 3.CXCR1表达差异可能在肿瘤发生发展及耐药过程中起着关键作用。
趋化因子受体1;胃癌;CXCR1细胞;蛋白质组学;MKN45细胞系;差异蛋白
中南大学
硕士
基础医学
李景和
2013
中文
R735.2;R730.21
71
2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）