日落黄和胭脂红酶联免疫吸附测定法的建立
化妆品、食品及医药用品中常使用人工合成色素改善其产品的色泽，因为与天然色素相比，它们价格更加低廉、色泽更稳定，并且可以多种色素混合调色。偶氮类合成色素是合成色素中最大的一类，约占60％-70％。日落黄和胭脂红都是常用的偶氮类合成色素，常用于药品、化妆品、食品的着色。但由于偶氮类合成色素及其代谢物潜在的多种毒理学作用如致癌性、致突变性、肝肾毒性等越来越多地被研究证明，因此对于偶氮类合成色素作为食品添加剂使用的安全问题越来越多地受到全世界科研工作者的重视。各国食品监督管理组织对合成色素的使用种类和使用量都有严格的规定，我国《食品添加剂使用卫生标准GB2760-2011》对于日落黄和胭脂红等合成色素在不同食品中的添加量也有着严格的规定。但食品添加剂非法使用的事件仍然频频发生，一些恶性事件甚至直接威胁到人民的生命安全，让广大消费者对食品添加剂望而生畏。因此，我们需要开发一种实用的方法对合成色素的添加量进行严格控制，从而保障人类的健康。
目前常用于日落黄和胭脂红等偶氮类合成色素的定量测定的方法主要有高效液相色谱法、分光光度法、毛细管电泳法等，高效液相色谱法及毛细管电泳法具有操作简单、易于自动化、检测速度快等优势，但也具有检测成本高、不利于现场检测等劣势。分光光度法是应用较早的一种分析方法，它适用范围广、仪器设备简单、分析成本低，但缺点是准确度不高。本实验致力于开发一种灵敏、准确、快速、简便的分析方法对食品中的日落黄和胭脂红色素进行添加量检测，为食品中合成色素的质量控制提供合理的方法。
免疫分析法的最大特点就是特异性很高，并且应用范围广，具有操作简单、易于现场操作、灵敏度高等优势，非常适合食品添加剂、农药残留、药物杂质等微量物质的检测，并且已有文献报道将免疫分析法应用于苏丹红、柠檬黄等合成色素的检测，得到了很高的灵敏度及极低的检测限。本实验建立两种间接竞争酶联免疫分析法对日落黄和胭脂红进行定量测定。
根据日落黄及胭脂红自身的结构特征，本实验设计合成了其结构类似物作为半抗原，以避免瓦变异构现象，并且采取EDC法、混合酸酐法等常用的蛋白偶联方法成功合成了免疫原及包被抗原。将免疫原注射到新西兰大白兔颈背部，心脏采血后得到多克隆抗体，检测抗体效价、方阵实验筛选得到合适的抗体，建立了合适的酶联免疫分析法，建立的ELISA法具备高精密度、高准确度，并能够成功用于食品中日落黄和胭脂红的检测。其中日落黄测定方法的灵敏度达到0.52 ng/mL，标准曲线的方程为y=0.44651-0.21529x，工作范围是0.01ng/mL-10 ng/mL。日落黄抗体与各种结构相似的色素发生交叉反应的概率与结构相似度相关，但总体交叉反应率都很低，均在1.5％以下。在碳酸饮料、豆干、卤肉中的检测限分别为0.12 ng/mL、0.04 ng/mL、1.11 ng/mL，加样回收率均在93.21％～106.25％之间，变异系数均小于15.47％。
胭脂红检测方法的灵敏度为36.82 ng/mL，建立方法的标准曲线方程为y=0.981550.15373x，工作范围是1 ng/mL-10000 ng/mL。胭脂红抗体与5种结构相似的色素发生交叉反应的概率均在0.3％以下，具有很高的特异性。同时对方法的精密度进行了考察，在3天内每天重复5次检测，得到的批内变异系数在1.7％-6.5％之间，批间变异系数低于17.7％。本实验还将此方法同HPLC法进行了对比，HPLC法标准曲线的工作浓度为40-300μg/mL，比ELISA法的线性范围窄，两种方法的回收率在98.82％-110.27％之间。但以上结果都是在PBS缓冲液体系中进行的，还需要进一步研究本方法在食品体系中的应用。
通过本实验的研究，我们成功制备了日落黄和胭脂红的半抗原及其多克隆抗体，建立了日落黄和胭脂红定量测定的酶联免疫分析法，为开发商品化的试剂盒奠定了良好的基础，并为其它合成色素酶联免疫法的开发提供了参考依据。
日落黄;胭脂红;多克隆抗体;酶联免疫分析法;定量检测;合成色素
南开大学
硕士
药物化学
郗日沫
2013
中文
TS207.3
71
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）