利用植物油体蛋白系统表达神经保护肽Humanin的研究
阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一种在老年人中常见的疾病，常伴有记忆力减退、迟钝、痴呆等症状，其发病率和人口的老龄化成正比。此病严重影响了患者的正常生活，是于癌症、中风和心脑血管疾病之后的又一类危害人类健康的重大疾病。Humanin蛋白对AD有关基因突变引起的细胞损伤具有保护作用，后来的研究认为，Humanin还具有更广泛的药用价值，是一种重要的药用蛋白，市场需求潜力巨大。植物生物反应器是生产外源蛋白的有效方法，具有生产成本低，安全性高等特点，人们已经利用植物生物反应器成功表达了酶和抗体等多种外源蛋白。作为生物反应器的一种，植物油体蛋白系统能够在种子中高水平表达外源蛋白，具有亲水亲脂双重特性，其中部疏水区高度保守，呈发夹结构镶嵌在油体的内部，决定了在油体上的定位，而两端碱基序列差异比较大，故外源蛋白插入其任何一端都对其在油体上的定位毫无影响，最重要的是融合蛋白容易分离纯化。本研究利用花生油体蛋白系统表达Humanin蛋白，寻求新的植物生物反应器载体、优化表达条件，对农学、基因工程和生物制药的研究具有重要意义。
本研究初步建立了花生油体蛋白(oleosin)系统表达Humanin的技术体系，并在烟草种子中表达了Humanin蛋白，为在花生中生产Humanin蛋白奠定了基础。主要研究内容和结果如下:
Humanin基因的合成:设计并合成部分互补的两条单链DNA引物（分别带有相应的酶切位点和修饰序列），经克隆测序得到Humanin基因的正确克隆。
植物表达载体的构建:将Humanin基因连接在花生oleosin基因的3'端，中间以肠肽酶编码序列连接，分别以35S组成型启动子和花生oleosin启动子驱动表达，构建了pCAMBIA2300-oleopromoter-Aholeosin-Humanin和pCAMBIA2300-35S-Aholeosin-Humanin植物表达载体;将oleopromoter-Aholeosin-Humanin表达单元构建到含有GUS的pCAMBIA1301载体中，得到了植物表达载体pCAMBIA1301-oleopromoter-Aholeosin-Humanin-GUS;将oleopromoter-Aholeosin-Humanin表达单元构建到含有GFP的pCAMBIA1302载体中，得到了pCAMBIA1302-oleopromoter-Aholeosin-Humanin-GFP植物表达载体。
烟草的转化和Humanin表达的研究:将带有目的基因的植物表达载体通过农杆菌介导的方法侵染烟草，在含有相应抗生素的培养基上筛选再生植株。对于pCAMBIA2300-oleopromoter-Aholeosin-Humanin和pCAMBIA2300-35S-Aholeosin-Humanin两个载体，提取烟草叶片的DNA，PCR扩增目的片段，筛选转基因阳性烟草株系;利用RT-PCR的方法从RNA转录水平检测外源蛋白的表达情况。对于含有GUS和GFP标签的两个植物表达载体，直接将转基因植株的T1代种子分别进行GUS染色和GFP观察来检测外源蛋白的表达。
结果如下:构建的4个载体均得到了25株的阳性植株;RT-PCR的结果表明外源基因在RNA的水平高水平表达;转基因后代烟草种子的GUS染色观察说明外源蛋白在种子中高水平表达;对转基因烟草T2代种子进行了纯合体的筛选，现已得到33个株系的纯合体。以上结果均表明花生油体蛋白系统能够作为生物反应器有效表达外源蛋白。
Humanin基因;生物反应器;植物油体蛋白;神经保护肽;合成设计
广西大学
硕士
作物栽培学与耕作学
周凤珏
2013
中文
Q943.2
63
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）