广西眼镜蛇CT和PLA2基因的真核表达和镇痛活性检测
眼镜蛇神经毒素(Neurotoxin，NT)是一种潜在的麻醉剂和解毒药物，在医用研究领域发挥巨大的作用。但由于蛇毒的产量小且分离难度大，限制了蛇毒在医用上的应用范围。因此，本研究旨在利用昆虫杆状病毒表达系统在体外获得具有镇痛活性的广西眼镜蛇蛇毒蛋白（Cobortoxin，CT）和凝脂酶A2(Phospholipase A2，PLA2)。
分别利用分段克隆和反转录PCR的方法克隆了广西眼镜蛇CT和PLA2基因的编码序列。然后将携带和不携带His标签的CT和PLA2插入杆状病毒穿梭载体pFastBacTM Dual启动子PH和p10的下游，获得不携带His标签的重组质粒:pD-CT、pD-PLA2、pD-CT-PLA2和携带His标签的重组质粒:pD-H-CT、pD-H-PLA2、pD-HCT-HPLA2。将6种穿梭载体转入DH10Bac中，用抗生素（庆大霉素、卡那霉素和四环素）和蓝白斑筛选、PCR和测序鉴定，得到携带目的基因的6种昆虫病毒表达载体:BM-CT、BM-PLA2、BM-CT-PLA2、BM-HCT、BM-HPLA2、BM-HCT-HPLA2。
利用转染试剂CellfectinⅡ将携带目的基因的6种昆虫病毒表达载体和空载体转入Sf9昆虫细胞，经PCR鉴定，成功获得了7种病毒颗粒。用病毒颗粒感染细胞，经SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达，结果显示，在细胞裂解上清中检测到特异目的条带，提示目的蛋白是可溶的。
分别利用电洗脱和Ni柱亲和纯化的方法成功从细胞裂解上清中纯化出不携带His标签的目的蛋白CT和PLA2和携带His标签的目的蛋白HCT和HOLA2。用小鼠的扭体实验检测其镇痛活性，结果显示:CT镇痛效果极显著(P＜0.05)，并且Ni柱纯化的效果显著好于电洗脱(P＜0.05)。HPLA2的镇痛效果不很明显(P＞0.05)。
广西眼镜蛇;蛇毒蛋白;凝脂酶A2基因;昆虫表达系统;镇痛活性
广西大学
硕士
动物遗传育种与繁殖
蒋和生
2013
中文
R996.3;R965
85
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）