非Piezo依赖的小鼠显微授精新技术改良及其应用研究
小鼠的繁殖周期短，遗传信息丰富，其卵子、胚胎易于获得和培养，是进行ICSI研究的理想动物模型。但小鼠的Piezo-ICSI技术与人类卵子的ICSI技术在操作温度、破膜原理等方面存在较大差异，不能够很好地模拟人类卵子的ICSI操作。前期研究通过改良显微持卵针建立了一种非Piezo依赖的小鼠ICSI技术(New-ICSI，N-ICSI)，在保证高存活率(83％)的前提下最大程度地贴近了人类的ICSI操作。然而该技术与Piezo-ICSI相比其卵子存活率和囊胚发育率还不是非常理想，尚待进一步的优化。本研究将原N-ICSI的穿刺破膜的操作分割成浅吸持浅穿刺和深吸持深穿刺两步后显著提高了该技术的卵子存活率(92.5％ V.S.81.1％，p＜0.01)，其操作效率也显著提高（18.9枚/小时V.S.15.6枚/小时，p＜0.01）。本研究为小鼠非Piezo依赖的ICSI操作方法的应用和推广奠定了坚实基础，为人类ICSI技术安全性的动物模型研究（如精子弱激活力模型研究等）提供了更便捷高效的途径。
在人类临床应用中有2％～3％的ICSI周期完全受精失败，其主要原因在于卵子未能被激活。人工辅助激活可帮助低或无激活能力的精子或卵子激活，提高受精率，在临床应用中逐渐得到了推广。然而由于缺乏合适的研究模型，目前还罕有精子激活力的影响因素、激活力降低的机理、辅助激活的安全性等方面的相关研究。本研究通过将精子脱尾处理后于4℃或37℃预孵育一定时长(0h、2h、4h、8h、12h)探讨分析了使精子激活力降低的因素，通过对显微授精后双原核形成率及卵裂率等指标的观察来判断精子激活力的减弱程度，以期建立精子激活力减弱程度可控的新技术。结果表明:精子脱尾处理后于4℃预孵4h后其正常受精率与对照组相比略有下降但无统计学差异(74.6％ V.S.81.5％，p＞0.05)，而于37℃下预孵4h后则显著下降(35.3％VS.81.5％，p＜0.05)。精子脱尾处理后随着在37℃下预孵时长的增加，其正常受精率呈逐渐下降的趋势。预孵时长达到2h、4h时与对照组相比正常受精率已受到显著影响(56.0％、42.7％ V.S.82.7％，p＜0.05)，达到8h、12h后则进一步显著下降(p＜0.05)，分别为25.3％、13.5％.此外，脱尾的精子在37℃预孵育的时长超过2小时后，尽管其保持了DNA的完整性但胚胎发育仍受到了显著的影响。通过人工辅助激活处理脱尾后37℃预孵4h处理组的合子，可使其正常受精率和囊胚率恢复至接近对照组水平(74.6％ V.S.84.2％，42.0％ V.S.48.2％，p＞0.05)，但囊胚的质量明显下降，发育迟滞，碎片增多，孵化率显著降低(4.0％VS.27.1％，p＜0.05)。综上所述，可以通过控制精子脱尾后于37℃预孵育的时长来控制精子激活力的减弱程度，这将为受精机理研究及辅助激活安全性的相关研究等提供重要实验模型。
卵胞膜;卵子激活;精子激活力;显微授精;技术改良
广西大学
硕士
动物遗传育种与繁殖
卢晟盛;吕祁峰
2013
中文
S814.8
59
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）