奶牛乳房炎病原菌分离鉴定及其多重PCR检测方法的建立
为了系统了解金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌在奶牛乳房炎疾病病原中的分布情况，本试验选择了广西壮族自治区6个规模化奶牛场，开展该三种菌的细菌分离与鉴定;并研究建立针对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌的奶牛乳房炎多重PCR检测方法。
本研究主要内容包括：⑴对广西壮族自治区6个规模化奶牛场采集的150份奶牛乳房炎奶样进行细菌分离鉴定，采用培养基鉴定、染色鉴定及生化试验鉴定等方法进行细菌学检测。试验结果表明:共检出22株金黄色葡萄球菌、34株大肠杆菌、6株蜡样芽孢杆菌，检出率分别为14.7％、22.7％、4.0％;与金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌相比，大肠杆菌在5个奶牛场的检出率均居首位，其总检出率也位居第一。62份被细菌感染的奶样中有48份为混合感染，混合感染率达77.4％。⑵针对金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌16S-23SrRNA基因和蜡样芽孢杆菌hblA基因，运用Primer5.0和Oligo7.0软件设计了3对特异性引物;采用正交试验探索和优化PCR反应体系及反应条件，从而建立金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌的奶牛乳房炎多重PCR检测方法，并对50份临床奶样进行检测。多重PCR反应体系及反应条件优化结果表明:10×PCR Buffer2.5μL、dNTPs（各2.5mmol/L)2.0μL、Mg2+(25mmol/L)1.5μL,Taq酶（5U/μL）0.2μL，金黄色葡萄球菌上下引物（50 pmol/μL）各0.1μL、大肠杆菌上下引物（50 pmol/μL）各0.3μL、蜡样芽孢杆菌上下引物（50 pmol/μL）各0.5μL、混合模板3μL，加水至25μL。最佳退火温度56.8℃;最佳循环次数为35次;特异性试验结果表明:试验菌株均扩增出与引物设计一致的扩增产物片段，即金黄色葡萄球菌249bp、大肠杆菌375bp、蜡样芽孢杆菌499bp。而其他非阳性菌株未扩增出目的DNA片段。敏感性试验结果表明:该多重PCR检测方法对3种菌基因组DNA的最低同时检出量为10pg/μL。测序结果表明:对扩增产物片段进行克隆测序，将其测序结果与GeneBank中对应的基因序列进行同源性比对，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌的同源性分别为100％、99％和99％。临床试验结果:对50份奶样同时进行细菌学检测和本试验建立的2个多重PCR检测，两者相比符合率为92％，就检出率而言，PCR检测方法高于细菌学检测方法。
奶牛养殖;乳房感染;病原细菌;菌株鉴定
广西大学
硕士
临床兽医学
何宝祥
2013
中文
S858.23;S852.61
66
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）