奥美沙坦通过拮抗心肌锚定重复蛋白减轻小鼠心脏重构及心力衰竭
研究背景:
心力衰竭是各种心血管疾病发展的终末阶段，为心血管疾病最常见的死因。心力衰竭的病死率高，5年存活率与恶性肿瘤相仿，严重影响患者的生活质量。目前临床上能够改善心力衰竭预后的药物主要有β受体阻断剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂(ARB)以及醛固酮受体拮抗剂等。其中，奥美沙坦酯，作为一种新型血管紧张素ⅡAT1受体阻断剂，口服后在小肠壁完全去酯转化成活性代谢产物奥美沙坦(RNH-6270)而起作用。既往研究表明:奥美沙坦酯在降低舒张压方面明显优于其他同类产品，而且该药服药剂量小、咳嗽等副作用少，被视为一线降压药物的良好选择。近些年最新研究表明:奥美沙坦酯在降压的同时能显著减轻心肌重塑，对心、肾等靶器官具有保护作用，但其作用机制尚不完全清楚。因此，探索奥美沙坦酯新的作用机制，将为预防和治疗心衰药物的研发提供有效的新靶点。
近十年来，大量的临床及动物实验研究证明:心肌锚定重复蛋白(cardiacankyrin repeat protein，CARP)是心肌肥厚及心力衰竭的新型标志物，在心肌肥厚及心力衰竭中表达显著升高。同时有研究表明:血管紧张素Ⅱ、主动脉弓缩窄(TAC)手术均可诱导CARP的表达升高，参与心肌肥厚及心力衰竭的病理生理过程。而奥美沙坦主要通过特异性的阻断血管紧张素ⅡAT1受体发挥一系列的药理作用，那么奥美沙坦对CARP是否有干预作用以及CARP是否是奥美沙坦减轻心肌重塑、改善心功能的新的作用靶点，至今没有相关报道。因此，我们设想CARP可能是奥美沙坦新的作用靶点，奥美沙坦通过特异性阻断AT1受体下调CARP的表达而发挥减轻心肌重塑、改善心功能的作用。那么，奥美沙坦又是怎样通过下调CARP的表达而发挥减轻心肌重塑、改善心功能的作用的呢？尽管有证据表明:表达CARP的基因突变参与肥厚性心肌病及扩张型心肌病的病理过程，但是过表达CARP对心肌肥厚及心力衰竭的利弊还不清楚，其作用机制也不明确。当然，众多研究表明:CARP与肌联蛋白和肌钯蛋白的结合增加可能导致肥厚性心脏病，且CARP与心肌细胞凋亡密切相关，可能参与Calpains调节的促进心肌肥厚及心衰的信号通路，包括calcineurin，p53等信号分子。因此，我们推测CARP对心肌细胞有损害作用，抑制CARP的表达及干预其作用过程可能是治疗心衰的一项新的措施。
研究目的:
本研究以血管紧张素Ⅱ受体1拮抗剂（ARB）奥美沙坦干预治疗，探索奥美沙坦与CARP的关系;并以AngⅡ刺激的心肌细胞肥大及主动脉弓缩窄(TAC)手术诱导心肌肥厚为实验模型，采用腺病毒过表达的方法探讨CARP对心肌肥厚及心衰的影响及其作用机制。本研究拟解决以下几点:
1，奥美沙坦与CARP的关系以及CARP是否是奥美沙坦新的作用靶点。
2，过表达CARP对心肌细胞肥大及凋亡的影响。
3，CARP是否能调节Calcineurin，p53及线粒体功能。
4，过表达CARP是否加重TAC诱导的心肌重塑及心功能紊乱。
研究方法:
1.细胞培养及处理
体外分离培养1-3天的SD大鼠心肌细胞，分别加入1uM的血管紧张素AngⅡ，环孢素A(CsA)，奥美沙坦酯的活性成分奥美沙坦RNH-6270，及过表达CARP腺病毒处理。用Realtime-PCR分析ANP，β-MHC基因的表达水平，WesternBlot的方法检测CARP，P53，P-P53，Bax，Calcineurin蛋白的表达水平。心肌细胞的存活率及细胞的凋亡分别采用MTT法和Hochest33258来检测。而细胞面积大小是通过罗丹明鬼笔环肽染细胞骨架来观察，并用Image J软件测量定量。
2.过表达CARP蛋白腺病毒的构建
采用PCR和体外连接的方法构建过表达CARP蛋白的腺病毒。我们将大鼠乳鼠ANKRD1基因的全长cDNA插入到穿梭质粒pDC316。利用Ad-MAX腺病毒系统将重组质粒pDC316-ANKRD1与腺病毒骨架质粒pBHGloxdelE13cre通过lipofectamine2000共同转染到293细胞，成功的包装出过表达腺病毒pDC316-mCMV-EGFP-ANKRD1。细胞过表达CARP是通过转染感染复数(MOI)为10的过表达腺病毒（Ad-CARP）48h，阴性对照为转染等量的空病毒(Ad-EGFP)，小鼠心脏特异性过表达CARP则是直接将病毒注射到心脏左室壁。
3.细胞免疫荧光
为了检测CARP及NFAT蛋白在细胞中的分布，我们将心肌细胞种在玻底皿中培养，通过标准的细胞免疫荧光步骤操作后，在confocal显微镜下观察CARP及NFAT在细胞中的分布情况。同样，我们也通过免疫荧光的方法检测各组细胞中线粒体膜电位的变化情况。心肌细胞用TMRE(四甲基罗丹明已酯)和DAPI标记后在confocal显微镜下观察，通过红色荧光的强弱变化来评价其线粒体膜电位的改变。
4.心肌肥厚模型的建立
8-10周龄C57BL/6雄性小鼠，体重约22-25 g，戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，插管，开胸，按照文献介绍的方法通过主动脉弓缩窄(TAC)制作左室压力负荷模型。超声测量是在TAC术后4周进行，然后将小鼠处死。其中一部分TAC小鼠在手术后立即给予奥美沙坦药物治疗，给药的方式是将药物添加在食物里，治疗四周后处死小鼠。另一部分小鼠在TAC术后两周进行腺病毒心肌注射，使心脏特异性过表达CARP，注射病毒2周后用超声评价心功能指标并处死。心肌细胞通过染麦胚凝集素测量其横截面积大小。
5.统计分析
计量数据以均数±标准误（mean±SE）表示，统计显著性差异分析采用t检验或者one-way ANOVA，多重比较采用Bonferroni's矫正。此外，变量的线性分析采用最小二乘法。在所有的统计中，P＜0.05被认为有统计学意义。
结果:
1.奥美沙坦酯通过下调CARP的表达减轻TAC诱导的心肌肥厚及改善心功能
RT-PCR和Western Blot结果表明:在心肌细胞中，奥美沙坦酯的活性成分奥美沙坦RNH-6270(10-6mol/L)能显著的减轻AngⅡ刺激诱导的ANP基因和CARP蛋白表达水平的上调。在TAC小鼠中，奥美沙坦酯治疗后显著的抑制TAC诱导的CARP的升高。另外，与TAC小鼠相比，奥美沙坦酯治疗4周后的TAC小鼠的心重体重比（HW/BW:TAC小鼠组:6.23±0.09mg/g;奥美沙坦治疗组:5.02±0.33 mg/g，P＜0.01）和肺重体重比(LW/BW:TAC小鼠组:7.62±0.30 mg/g，奥美沙坦酯治疗组:6.04±0.17mg/g，P＜0.01)都显著降低。这些结果都表明奥美沙坦酯通过下调CARP的表达从而减轻TAC诱导的心肌肥厚及心功能紊乱，CARP是奥美沙坦作用的一个新的治疗靶点。
2.CARP是心肌肥厚的可靠的标志物
由于BNP（B-型钠尿肽）是心肌肥厚及心衰的可靠的标志物，因此我们研究TAC4-8周小鼠的ANKRDI与BNP表达的相关性。相关性研究表明心肌ANKRD1表达水平与BNP的表达水平呈正相关(r=0.914，P＜0.01，n=15)。同时，还进行ANKRD1与心重体重比的相关性研究，结果表明ANKRD1的表达与心重体重比呈正相关(r=0.934，P＜0.01)。Western Blot结果也表明:与假手术相比较，TAC手术能显著的上调CARP的表达。同时，在细胞水平上AngⅡ刺激使CARP的表达呈时间和浓度依赖性升高。荧光免疫结果表明AngⅡ刺激促进CARP在细胞质中的定位，而这种作用可被calpain inhibitorⅠ所部分抑制。而免疫荧光结果表明转染过表达CARP腺病毒主要使细胞质中的CARP表达增加。这些结果都表明CARP是心肌肥厚的可靠的标志物。
3.过表达CARP加重AngⅡ诱导的细胞肥大
单独转染过表达CARP腺病毒能使ANP，β-MHC的表达显著升高(P＜0.01)，在AngⅡ刺激的病理状态下能进一步上调AngⅡ诱导的肥厚标志基因ANP，β-MHC的表达上调(P＜0.01)。由于calcineurin/NFAT信号通路是一条很重要的促肥厚的分子通路，因此我们检测CARP对calcineurin/NFAT通路的影响，进一步确定CARP促进心肌肥厚的作用。Western结果表明过表达CARP能上调calcineurin的表达(P＜0.01);而细胞免疫荧光可以观察到过表达CARP使NFAT发生核转位。通过细胞面积的检测，发现CARP可以进一步加重AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，且这种作用被calcineurin的抑制剂CyclosporinA(CsA)所抑制。这些结果表明CARP主要通过calcineurin/NFAT信号通路促进心肌细胞肥大。
4.过表达CARP促进心肌细胞发生凋亡
MTT和Hochest检测结果都表明过表达CARP显著降低心肌细胞生存率及增加心肌细胞的凋亡。为了探讨出CARP促进细胞凋亡的机制，我们检测与凋亡有关蛋白的表达，Western结果表明CARP能进一步促进AngⅡ诱导的P53，P53磷酸化蛋白P-P53，及线粒体中Bax蛋白表达的增加。此外，通过四甲基罗丹明已酯检测与细胞凋亡相关的线粒体膜电位，confocal显微镜观察结果表明过表达CARP降低线粒体膜电位，通透性增加。
5.心脏过表达CARP加重TAC诱导的心肌重塑及心功能紊乱
通过心肌注射腺病毒使心脏特异性过表达CARP。与TAC小鼠相比，注射过表达CARP腺病毒2周后的TAC小鼠，其心重体重比显著增加(TAC+Ad-CARP组:8.69±0.38 mg/g vs.TAC+Ad-EGFP组:6.04±0.15 mg/g，P＜0.01)。类似的，肺淤血指数肺重体重比在注射过表达CARP的TAC小鼠中明显增加(11.0±1.25mg/g vs.6.97±0.38 mg/g，P＜0.05)。其次，TAC手术诱导的心肌横截面积及ANP的表达水平都因为过表达CARP而显著增加(p＜0.01)。超声结果表明在转染过表达CARP的TAC小鼠中左室舒张末内经(LVESd)及左室收缩末内径(LVEDd)都比注射空病毒的TAC小鼠大(p＜0.05)，且左室短轴缩短率(LVFS％)显著下降(p＜0.05)。此外，提取心脏组织蛋白，western结果表明心脏特异性过表达CARP的TAC小鼠中calcineurin，P53，P-P53的表达及Tunel检测的细胞凋亡阳性率显著升高。这些结果都表明过表达CARP加重TAC诱导的心肌肥厚及心功能紊乱。
结论
1.奥美沙坦酯可以抑制CARP的表达及其对心脏的损害作用，从而减轻TAC诱导的心肌重塑及心功能紊乱，表明CARP是奥美沙坦酯新的作用靶点。提示抑制CARP的表达及其作用可能是治疗心衰的一项新治疗措施。
2.CARP是心肌肥厚的标志分子，增加胞浆中的CARP通过calcineurin/NFAT信号通路促进心肌细胞肥大。
3.CARP通过激活P53细胞凋亡途径，降低细胞线粒体膜电位，促进心肌细胞的凋亡，对心脏细胞存在损害作用，从而促进心肌肥厚向心衰的发展。
奥美沙坦酯;心肌肥厚;细胞凋亡;心力衰竭;心肌锚定重复蛋白;动物模型
南方医科大学
硕士
药剂学
李国锋;廖禹林
2013
中文
R541.6
86
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）