功能化多肽量子点的制备及其生物医学应用
研究背景:半导体纳米晶体，也被称为量子点，具有独特的光学、电子特性。因此，被广泛应用于发光设备、激光器、太阳能电池、生物标记和生物成像领域。量子点作为一种半导体纳米晶体与有机染料相比，具有以下几个优点:比如可以通过调控粒径的大小来改变荧光发射波长，量子点可调节的波长范围从400nm-2000nm，覆盖范围很广，从紫外到近红外区域;有宽的的激发光谱和窄且对称的发射光谱;量子点的吸收光谱宽并且连续，同一波长的光可以同时激发不同尺寸的量子点而发出不同颜色的光，因此能够实现一元激发，多元发射，在生物成像领域适用于多色标记;很高的荧光量子产率，量子点的摩尔吸光系数高达106 L/(mol·cm)，因而可以产生较强的荧光信号;良好的耐光性和耐光漂白性;量子点的斯托克斯位移比较大，荧光寿命比较长(20-50ns)，使得信号能够显著的把背景和其它荧光基团区分开来，所以可应用在时间分辨光学成像等。这些使他们成为理想的生物标记和生物成像的材料。
虽然通过三辛基膦-氧化三辛基膦(TOP-TOPO)的有机相合成方法制备的高荧光的Ⅱ-Ⅵ族半导体量子点方法已经很成熟了，但在生物应用上，这些疏水性的量子点需要通过双官能团的巯基配体、二氧化硅和聚合物等修饰剂进一步修饰使它们具有亲水性和生物相容性。不足的是，这些额外复杂的修饰过程，导致量子点的粒径变大并且荧光量子产率也降低很多，这是不利于在生物中应用的。为了克服这些缺陷，近年来，发展了以巯基为表面修饰试剂的水相合成量子点的方法。经过大量的努力，已经取得了重大的进展并且量子点的质量可以比得上用有机金属合成的方法制备的量子点。CdTe量子点是一类研究最广泛的量子点，已经被深入的研究和表征，具有不同粒径大小的碲化镉量子点由于强大的量子限制效应，它的荧光几乎可以覆盖整个可见光谱范围。CdTe量子点已经被广泛应用于各个领域，从电子设备到传感器，尽管如此，但是它们的生物应用仍然是受限制的。这是因为它们在活细胞实验中会从巯基修饰的碲化镉量子点释放出有毒Cd2+离子而引起细胞毒性。近红外量子点对体内成像不仅需要很好的光学性能，并且应具有很小的粒径和减少有毒的元素，如Cd、Pb和Hg等。然而，制备小粒径和低毒的近红外量子点应用在生物影像上仍是一个挑战。因此有必要发现一种新的、可溶于水的、高荧光强度、低镉或无镉的量子点，具有小的粒径和较低的细胞毒性，从而实现它们在生物学中广泛的应用。
本课题主要研究在水相中合成量子点，通过改变反应条件来对优化量子点的合成，从而找到最佳的实验条件。进而一步合成功能化的多肽量子点，这种多肽功能化的量子点可以直接应用在生物标记、生物传感和生物成像上，合成方法简单，易操作，实验安全性高，试验中选择了四种不同的多肽以证明水相一步合成方法的通用性。通过比较不同反应条件下量子点吸收和发射、量子点的荧光及胶体稳定性、在不同pH、不同盐离子浓度中的稳定性、细胞成像和细胞毒性等试验来考察所合成的量子点。除了镉系的量子点，我们也对绿色无毒的Zn和Ag系量子点进行了研究，并比较了新型的量子点与传统量子点在对细胞活性上的影响，在进一步扩大量子点在生物学上的应用范围打下了基础。
第一部分:CdTe量子点的水相制备及其性能研究
本部分主要研究CdTe量子点的水相制备，在水相中一步合成了尺寸较均一，分散性良好的CdTe量子点。分别采用α-硫代甘油、巯基乙酸、巯基丙酸、L-半胱氨酸和乙酰半胱氨酸作为表面修饰剂，在水溶液中直接合成了CdTe量子点，通过优化反应条件如反应时间、不同表面修饰剂和Cd、Te比例等，单因素考察了CdTe量子点光学性能的变化规律。通过紫外吸收、荧光发射、荧光量子产率和半峰宽等光学性能的比较，我们发现α-硫代甘油做表面修饰剂时合成CdTe量子点的成核及生长速度最慢，巯基乙酸做表面修饰剂时合成CdTe量子点的成核及生长速度最快，还可以看出以α-硫代甘油做表面修饰剂时，合成的CdTe量子点半峰宽较窄，说明量子点的分散性较好;以乙酰半胱氨酸做表面修饰剂时，合成的CdTe量子点的量子产率较高;改变Cd、Te比例的试验中，我们发现Cd、Te比例为1∶1.23时，生成的量子点半峰宽比较窄，量子产率比较高;并且经共聚焦显微细胞成像实验验证了α-硫代甘油做表面修饰剂时特异性吸附最小。
第二部分:一步合成功能化的多肽量子点及其在生物学上的应用
本部分在第一部分的基础上，根据优化的反应条件来进行试验。主要是介绍了一步合成功能化的多肽量子点。具体步骤如下:(1)以碲粉作为碲源，把0.040g碲粉和0.025g硼氢化钠加入离心管中，加入1ml超纯水，室温放置过夜，制得碲(Te)的前体溶液;(2)以氯化镉为镉源，在室温条件下，把称好的氯化镉0.0145g加入到50ml的超纯水中，搅拌至完全溶解，再加入12μlα-硫代甘油，混匀，用0.1M氢氧化钠逐滴加入调pH至11.0，制得镉(Cd)前体溶液;(3)取1ml镉的前体溶液，加入10μl碲的前体溶液和含有多肽的溶液(1mg/ml)，慢慢加热到100℃，反应1h停止加热，冷却至室温，即合成CdTe多肽量子点;合成CdHgTe量子点，只需要把不同比例的氯化镉和氯化汞混合溶液替代上述氯化镉溶液即可。硫代甘油和特定序列的多肽作为联合配体来稳定量子点，硫代甘油的羟基基团可以使量子点与细胞的非特异性吸附最小，多肽主要由三部分组成:一个组氨酸(His6)尾部，它可以超过同等的金属亲和力优先与量子点的表面结合;一个四聚体的聚乙二醇，它被引入作为间隔物，以减少非特异性的相互作用和改善溶解性;一种官能团或对生物有亲和力的肽序列，它可连接在聚乙二醇的末端。多肽功能化的量子点在生物传感检测、生物标记和生物医学成像都有很好的应用前景。研究过程中用紫外/可见光光度计、荧光光谱仪、纳米粒度及电位分析仪、激光共聚焦显微镜、透射电镜、酶标仪等对量子点进行表征，来考察量子点的吸收、发射波长、粒径大小、电位、细胞内成像、细胞内标记、细胞毒性、形貌及单分散性。
在本部分中我们提供了一个简便的方法制备了具有很好的胶体稳定性、高效的光学性能和约6nm的小粒径的即用的多肽功能化的量子点，这种方法简单并且十分可靠，没有涉及复杂的生物共轭或另外的可能会损害量子点稳定性和荧光强度的试剂，对以后大批量生产、快捷和可复制的生物传感检测、生物标记和生物医学成像都有潜在的可能。
第三部分:绿色无毒的量子点的研究
Zn系和Ag系的量子点是近年来人们研究较多的绿色低毒的新型的量子点，本实验也在其他组报道的基础上进行了一些探索，分别合成了Ag∶ZnSe、Ag2Se和Ag2S量子点，并对其进行了表征和细胞毒性实验的考察。生物成像中，量子点的理想发射波长应该在近红外区域以改善组织穿透深度和降低背景荧光。此外，近红外量子点对体内成像不仅需要很好的光学性能，并且应具有很小的粒径和减少有毒的元素，如Cd、Pb和Hg等。然而，制备小粒径和低毒的近红外量子点应用在生物影像上仍是一个挑战。对制备低毒性的荧光量子点来说，银硫属化合物是一个理想的窄能带隙半导体材料，不过，小的溶度积常数(Ksp=6.3×10-50)和Ag2S快速的晶体生长的情况很难得到粒径小的Ag2S量子点，即使如此，最近的硫化银量子点的制备已经取得了很大的进步。
在ZnSe量子点的基础上掺杂Ag+，合成了Ag∶ZnSe，考察了反应时间、Zn2+/Ag+/∶Se2-摩尔比例和不同表面修饰剂等因素的改变对合成Ag∶ZnSe量子点荧光性能的影响。结果发现无论是改变反应时间或Zn2+/Ag+/∶Se2-摩尔比例，Ag∶ZnSe量子点的发射波长几乎都不变，改变的只是荧光强度，经试验二硫代苏糖醇(DTT)、α-硫辛酸(DHLA)作为修饰剂时，合成的量子点有沉淀，且无荧光;α-硫代甘油反应时间较长，且荧光强度较弱，谷胱甘肽作为表面修饰剂较为理想。
合成的Ag2Se量子点在用荧光光谱仪检测时无荧光，故暂不能在生物学中应用。
通过改变反应时间或硝酸银和表面修饰剂巯基丙酸(MPA)的比例，来考察Ag2S量子点荧光性能的变化。实验证明，硝酸银与巯基丙酸(MPA)的比例为1∶12时波长调节范围比较大，且荧光强度较强;反应时间在7分钟时Ag2S量子点的量子产率最大，故上述比例和时间是合成Ag2S量子点的较优条件。通过细胞毒性试验，比较Ag2S和CdTe量子点的毒性，实验再次证明Ag2S量子点即使在很大的浓度120mg/L时对细胞活性都几乎没有影响，但CdT量子点则不然，Ag2S量子点为研究低毒或无毒的量子点在生物学中的应用打下了很好的基础。
水相合成;一步合成;功能化多肽量子点;生物应用;绿色无毒
南方医科大学
硕士
药剂学
陈建海
2013
中文
TB383;R318.08
82
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）