可通过BBB的BDNF融合蛋白保护脑缺血后神经元死亡的药效学和机制研究
研究背景:
脑源性神经营养因子(brain derived neuotrophic factor，BDNF)是1982年德国神经生物学家Barde等首次从猪脑中分离出来的具有防止神经元死亡功能的小分子蛋白质，它主要由神经元和神经胶质细胞产生，是神经营养因子家族中最具代表性的成员之一。BDNF在中枢神经系统发育过程中，对神经元的生存、分化、生长和功能起着重要的作用，在病理状态下，可促进损伤后神经元的修复。例如大脑缺血后，机体在没有外来因素干预下，内源性BDNF可通过自身代偿调节，提高神经元抵抗缺血的能力，促进受损神经元的修复、再生，调节神经结构的重建，促进脑损伤后认知功能的恢复。但机体自身的代偿能力有限，持续时间较短，随着脑缺血时间的延长，内源性BDNF表达逐渐降低，同时神经细胞损伤后的修复过程及其后的生长必须经历较长时间，内源性BDNF及其受体酪氨酸激酶受体(trkB)的上调尚不足以防治脑缺血性损伤及其以后的细胞死亡。大量实验表明给予外源性BDNF在抵抗神经损伤，促进神经元的修复、维持神经元的功能等方面的作用已经较为肯定。因此，应用外源性BDNF给药到达大脑发挥生物学功能将是治疗缺血性脑损伤的一个很有潜力的治疗方法。但由于血脑屏障的结构特点，限制了血液和脑组织之间的物质交换，因此，外源性蛋白很难通过血脑屏障，这也是至今为止，医药市场上几乎没有有效的用于预防和治疗神经系统疾病的蛋白类药物。如何解决血脑屏障通透性及脑靶向给药途径成为外源性BDNF应用的关键，也是医药及相关领域研究者迫切解决和关注的问题。
这就使得临床上急需一种有效的，非侵入性的方法使脑源性神经营养因子通过血脑屏障而发挥生物学效应，用以满足BDNF在神经退行性疾病方面的预防及治疗作用。目前在临床前试验研究中试探了许多的给药方法，主要分为两类:侵入性和非侵入性。前者主要包括脑血管内灌注或脑内注射给药;后者主要采用高分子技术或基因工程技术对BDNF进行修饰，主要有脂质体包裹药物;病毒基因治疗的给药途径;单克隆抗体偶联药物进行静脉给药等。但这些方法存在很多的不足:脑血管内灌注或脑内注射给药有极大的不顺应性，且给药后，药物分布在很小的部位;用脂质体包裹药物能增加药物的脂溶性，但脑组织对脂质体的摄入是绝对的非特异性的，同时也增加了药物的副作用和成本;病毒基因载体给药虽然是很好的入脑载体，但并不适合临床上的急性缺血的脑损伤的治疗，因为在脑损伤后很短的时间内给药才能对神经元细胞有保护和修复作用，而且病毒载体对人的免疫系统有副作用;单克隆抗体偶联药物进行静脉给药能够使得BDNF通过血脑屏障到达大脑而发挥生物学效应，但这种方法得到的药物，过程繁琐，半衰期短，成本高。如何寻找一种有效的，非入侵性的临床给药方法，使得BDNF进入大脑发挥生物学效应，这是目前我们最为关注和急待解决的问题。
来源于人免疫缺陷病毒的反式转录激活因子(Transactivator of transcription，TAT)能够跨膜导入细胞内部，具有细胞膜穿透肽(Cell membrane penetratingpeptide，CPP)活性，这一研究发现给我们解决这个问题提供了很好的思路。蛋白转导域（Protein transduction domain，PTD）是指那些小于20个氨基酸、带正电荷，可以穿过大多数细胞膜的穿膜肽(CPP)的一个富含碱性氨基酸区域，带正电荷的多肽片段，是行使蛋白转导功能的特殊结构域。可以携带大分子透过细胞膜进入几乎所有的哺乳动物细胞内，而无需特殊的环境。另外，穿膜肽对于结合物的大小没有严格的限制，已经在肿瘤，免疫治疗等很多临床前研究中取得了很大的进展，具有广泛的应用前景。
本课题组在前期研究中，克隆获得了编码成熟BDNF-PTD融合蛋白的基因，建立了能表达BDNF-PTD融合蛋白的大肠杆菌细胞系，通过纯化和鉴定，得到了BDNF-PTD，前期研究证明BDNF-PTD融合蛋白可通过血脑屏障进入大脑。在此基础上，本课题将对BDNF-PTD的药效学进行体内外研究，并对其作用机制展开了研究。
目的:
1、制备稳定性好、重复性强、成功率高的大鼠局部脑缺血模型。与普通尼龙栓线对比，确定通过石蜡包被后的栓线对于制备的大脑中动脉栓塞局部缺血模型的效果;同时，研究不同损伤再灌注方式对大鼠局部脑缺血模型神经功能缺陷、梗死面积、血脑屏障通透性的影响。
2、体外药效学研究，研究不同剂量的脑源性神经营养因子融合蛋白(BDNF-PTD)对体外培养大鼠胎鼠背根神经节轴突生长的影响;并观察验证BDNF经过与PTD重组后表达，纯化得到的融合蛋白是否具有和BDNF一样的生物学活性和功效。
3、体内药效学研究，研究不同给药时间，不同给药剂量BDNF-PTD对大鼠大脑缺血再灌注导致神经元损伤的神经功能缺陷，缺血梗死面积的影响，观察BDNF-PTD在脑缺血后对神经元的保护作用。
4、研究BDNF-PTD对大鼠大脑缺血再灌注损伤导致神经元损伤保护作用的可能机制。
方法:
一、大鼠局部脑缺血模型的制备及其优化实验
用普通尼龙栓线和改良栓线制备大鼠局部脑缺血/再灌注损伤模型。改良栓线制备方法:将尼龙栓线切成70mm，将线头置于浸满液体石蜡的0.28mm微管中。等石蜡凝固后，移开微管，为了保持栓线的一致性，最好同一个人制备完成。采用神经功能缺陷评分法以及TTC染色法，对比改良线栓与普通尼龙栓线制备大鼠大脑中动脉栓塞模型的效果。另外，通过神经功能缺陷评分法，TTC染色法以及伊文思蓝染色法分析不同栓塞/再灌注损伤方式对大鼠局部缺血模型神经功能缺陷、梗死面积、血脑屏障通透性的影响，并确定在后期实验中制备模型采取何种方式。
二、脑源性神经营养因子融合蛋白(BDNF-PTD)对大鼠胎鼠背根神经节轴突生长的影响
在体式显微镜下取大鼠胎鼠（E18-20天）背跟神经节，置于6孔板中，4个/孔，随机分组，阴性对照组（DMEM基础培养液）、阳性对照组（含BDNF的DMEM基础培养液，50ng/ml），实验组（含不同浓度BDNF-PTD的DMEM培养液，10ng/ml，50ng/ml，80ng/ml，100ng/ml），N=3。首先加入300μL相应的培养液，移入37℃、5％CO2培养箱内培养孵育4h，背根神经节贴壁后，补足相应的培养液至2mL.。48 h后，倒置显微镜下观察轴突生长形状态，并拍照。计算最长轴突长度（μm），和轴突的生长面积，各组的轴突生长面积用实验组与阴性对照组比较的百分比表示，轴突长度用μm表示。所有计量资料数据采用(x)±s表示，采用SPSS13.0统计学分析软件分析数据。
三、脑源性神经营养因子融合蛋白(BDNF-PTD)对大鼠局灶性脑缺血预防治疗作用的药效学研究
实验动物采用随机数字表法分为假手术组，空白模型组，给药组(50μg，100μg)。给药模型组在栓塞前和栓塞后一个小时腹腔注射BDNF-PTD50μg，100μg，大鼠大脑局部缺血/再灌注24小时快速取脑，用生理盐水洗去表面的血迹，在-30℃下冷冻10min。冠状面切片，每片2mm，37℃恒温箱中2％TTC避光染色10min，然后用多聚甲醛固定24小时。经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗塞区为白色。然后将固定好的各组大鼠大脑TTC染色切片用Wincats分析软件对其进行扫描，再用ImageJ软件计算各组的梗死面积，并进行分析。
四、脑源性神经营养因子融合蛋白(BDNF-PTD)对大鼠局部脑缺血治疗作用的机制研究
实验动物采用随机数字表法分为假手术组，空白模型组，给药组。给药模型组在栓塞后一个小时腹腔注射BDNF-PTD50μg，大鼠大脑局部缺血/再灌注24小时后，快速断头取脑，将脑组织迅速置于预冷的生理盐水中，漂洗数次，使用全蛋白提取试剂盒提取蛋白，此过程在冰上进行。之后通过免疫印迹法检测大脑中BDNF、P-Erk1/2、Erk1/2、PI3K以及内参GAPDH蛋白的表达。所得到的结果通过Gel-Pro专业图像软件分析。
结果:
一、大鼠局灶性脑缺血模型的制备及其优化实验
改良后的栓线制备大鼠局部脑缺血模型组（简称:cMCAO），其死亡率为0％，成功率为100％;而使用普通尼龙栓线制备大鼠局部脑缺血模型组（简称:uMCAO），其死亡率为10％，成功率为55％，其主要原因是由于栓线头尖锐导致颅内出血所致。大鼠大脑中动脉栓塞6小时后，进行神经功能缺陷程度的评分，改良栓线组(cMCAO)神经功能缺陷评分高于普通栓线组(uMCAO)，组间比较有差异(F=17.292，P=0.01)。通过大鼠CCA进线栓塞大脑中动脉后，12小时断头取脑，冠状切片，TTC染色，结果显示在普通栓塞组(uMCAO)中，只有11只大鼠大脑有梗死区域（2只死亡，7只模型失败）(n=20)，而在改良栓线组(cMCAO)中，所有实验大鼠都有梗死区域。软件分析计算得出cMCAO组的梗死面积大于uMCAO组，其平均梗死面积高于uMCAO组209.97％，组间比较具有差异(F=98.897，P=0.015)。
另外在两种缺血再灌注方式上，在Group C中，其灌注主要血液来源CCA和ICA，而在Croup W，其主要灌注血液来自Willis环(除了ICA)，数据显示但Group C评分比group W高，但统计分析结果显示两组动物神经功能缺陷无统计学差异(F=1.000，P=0.328)。大鼠栓塞后断头取脑，冠状切片，每片约2mm，TTC染色，结果显示group C组大鼠的梗死面积大于group W组大鼠124.79％，但两组梗死面积差异没有统计学差异(F=3.5，P=0.075)。
二、脑源性神经营养因子融合蛋白(BDNF-PTD)对体外培养大鼠背根神经节植块的影响
实验结果表明，DRG在DMEM基础培养液条件下，生长缓慢，培养48小时后，神经节轴突仍然没有明显生长。而BDNF-PTD共培养后可明显促进背根神经节轴突的生长。与阴性对照组相比，不同浓度的BDNF-PTD均可使轴突长度增加，生长面积增大。与阳性对照组相比，相同剂量的BDNF-PTDT对促进背根神经节轴突生长和生长面积没有显著性差异。
在给药组中通过软件分析背根神经节轴突生长面积数据，各组比较有统计学差异(F=31.697，P=0.000)，各组药组能明显促进背根神经节数量的生长，50ng/m，80ng/ml，100ng/ml浓度的BDNF-PTD和阳性对照BDNF（50ng/ml）与10ng/ml浓度的BDNF-PTD对比，能更加促进神经节生长，差异有统计学意义(P＜0.05)，但80ng/ml与100ng/ml浓度的BDNF-PTD之间对比没有差异(P=0.131)，另外，50ng/ml浓度的BDNF-PTD与同等剂量的BDNF对比，其作用效果相当，差异没有统计学意义(P=0.660)。
在背根神经节轴突长度数据上，各组比较有统计学差异(F=11.651，P=0.003)，各组药物能明显促进背根神经节轴突的长度，50ng/ml，80ng/ml，100ng/ml浓度的BDNF-PTD和阳性对照BDNF(50ng/ml)与10ng/ml浓度的BDNF-PTD对比，轴突的长度更加明显，差异有统计学意义（P＜0.05），而50ng/ml，80ng/ml，100ng/mlBDNF-PTD与BDNF(50ng/ml)对促进轴突生长的效果虽然有一定的差异，但差异没有统计学意义(P＞0.05)。
三、脑源性神经营养因子融合蛋白(BDNF-PTD)对大鼠局灶性脑缺血预防治疗作用的药效学研究
栓塞前给药6小时，进行神经功能缺陷程度的评分，各给药组神经功能缺陷评分明显低于模型组和阴性对照组，各组比较有统计学差异(F=9.914，P=0.000)，进行组间多重比较，50μg、100μg给药组与栓塞组相比，神经功能缺陷明显降低，统计分析具有显著差异(P=0.000，P=0.000)，与阴性对照比较统计分析也具有显著差异(P=0.006，P=0.001)，但两给药组之间（50μμg100μg）比较没有差异(P=0.138)，MCAO与Vehicle没有统计学差异(P=0.481);栓塞后给药，6小时对动物进行神经功能缺陷程度的评分，各给药组神经功能缺陷评分明显低于模型组和阴性对照组，各组差异比较有统计学意义(F=3.883，P=0.014)，给药组50μg和100μg组神经功能缺陷得分明显小于模型组，统计分析有差异(P＜0.05)，但两组药物浓度之间神经功能缺陷评分差异没有统计学意义(P=0.373）;另外，两组给药组（50μg、100μg）跟阴性对照组比较，统计学有差异(P＜0.05），MCAO与Vehicle差异比较没有有统计学意义(P=1.000)
在大鼠大脑局部脑缺血模型制备前腹腔给药，24小时后快速断头取脑，切片。TTC染色后，对各组梗死面积百分比进行计算，各组之间差异有统计学意义(F=40.273，P=0.000)，栓塞前给药组与模型组对比，给予50μg，100μg蛋白对大脑梗死具有保护作用，大脑梗死面积明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，两药物浓度之间也有统计学差异(P=0.000);与阴性对照组对比，给予50μg，100μg BDNF-PTD融合蛋白后，大鼠大脑梗死面积明显降低，统计学有差异(P＜0.05)。另外在栓塞1小时后，对各组梗死面积百分比进行计算，各组比较有统计学差异(F=12.433，P=0.000)，两给药组大脑梗死面积明显低于空白模型组和阴性对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，但50μg，100μg两组之间的大脑梗死面积没有差异，统计分析没有意义(P=0.467)，空白模型组与阴性对照组之间也没有差异。
四、脑源性神经营养因子融合蛋白(BDNF-PTD)对大鼠局部脑缺血治疗作用的机制研究
在PI3K免疫印迹(western blot)结果灰度分析中，各组之间有差异(F=538.991，P=0.000)，与假手术，空白模型组栓塞部位，空白模型组非栓塞部位相比，给药组栓塞部位的PI3K蛋白表达水平均显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.01);与同一大脑的给药组非栓塞部位同样有差异;另外，给药组非栓塞部位与假手术，空白模型组栓塞部位，空白模型组非栓塞部位相比，PI3K蛋白表达水平均显著升高，差异有统计学差意义P＜0.01）。在pERK1/2westernblot结果灰度分析中，各组之间差异有统计学意义(F=320.039，P=0.000)，与假手术，空白模型组栓塞部位，空白模型组非栓塞部位相比，给药组栓塞部位pERK1/2表达水平均显著升高，具有统计学差异(P＜0.01)，而与给药组非栓塞部位无差异(P=0.957);另外，与假手术，空白模型组栓塞部位，空白模型组非栓塞部位相比，给药组非栓塞部位pERK1/2表达水平也明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05);而与给药组栓塞部位差异无统计学意义(P=0.957)。
结论:
一、通过改良栓线制备局部脑缺血模型，确定了改良栓线的确优于传统的栓线，改良栓线能更好地栓塞大脑中动脉，成功率高，具有更好的稳定性和重复性，因此，改良后的栓线具有更高的应用价值。另外，本部分确定了目前本领域中所存在的两种缺血再灌注方式对大鼠局部脑缺血梗死面积、血脑屏障通透性的影响，结果显示两种再灌注方式对大鼠脑缺血梗死面积，血脑屏障通透性没有影响;另外，Group W组更接近临床生理灌注方式，但这种手术操作方式困难，不利于模型制备;而Group W组灌注方式不同于生理灌注方式，但其操作方便，利于模型的制备。虽然两种方式都有自己的优势，且对相关的参数指标没有影响，且可互换。但从临床角度考虑，我们在后续实验中还是选择从ECA进线制备局部脑缺血再灌注损伤模型。
二、BDNF-PTD融合蛋白，可明显促进大鼠胎鼠背根神经节植块轴突的生长。在神经节轴突长度和生长范围（数量）上与阳性对照组BDNF相比，相同剂量的BDNF-PTD对促进背根神经节轴突长度和生长面积没有差异。说明BDNF经过与PTD重组后得到的融合蛋白具有和BDNF一样的生物学活性和功效作用。
三、通过在大鼠大脑中动脉栓塞前后不同时间点给药，以及给予不同的BDNF-PTD剂量，给药组跟空白对照组、阴性对照组相比，给药组的脑梗死面积明显小于模型组和阴性组，差异有统计学意义。另外根据神经功能缺陷的评分，给药组明显改善神经功能症状。通过上述的实验可以证明BDNF-PTD能通过血脑屏障发挥生物学效应，提高神经元抵抗缺血的能力，保护神经元和改善缺血后神经功能。BDNF-PTD的动物试验治疗效果为将来BDNF-PTD应用于临床脑损伤的治疗及BDNF-PTD的临床研究奠定了基础。
四、实验证明BDNF-PTD融合蛋白能通过血脑屏障并且能发挥其生物学效应，能很好的保护脑缺血后的神经元，促进神经元的生存，其作用的可能机制，通过实验证实BDNF-PTD是激活神经元内信号调节激酶(ERK)磷酸化以及在Akt信号通路中上调磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的表达而发挥其生物学效应。
脑源性神经营养因子;融合蛋白;脑缺血;药效学;动物模型
南方医科大学
博士
药理学
季爱民
2013
中文
R743.31
139
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）