CXCR7拮抗剂的构建及表达
一、背景
乳腺癌是目前女性发病率和死亡率排名第一的常见恶性肿瘤。2011年美国Cancer Journal for Clinicians杂志公布的统计数据显示，美国2011年有230480例女性罹患乳腺癌，其中57650例为新增原发性乳腺癌，占女性新发恶性肿瘤的30％。同样，在发展中国家或地区乳腺癌现在也是女性癌症死亡的主因，较十几年前以宫颈癌为常见的癌症死亡原因发生了转变。
乳腺癌具有发病率高、侵袭性强、病程进展缓慢、隐蔽性强、不易早期诊断、易于转移等特点。因此，对乳腺癌的发生、发展及转移的机制研究十分重要。乳腺癌是一种血管高度依赖性肿瘤。肿瘤微环境的改变、原发性乳腺癌的局部肿瘤微血管生成以及侵袭细胞外基质和基底膜等每一环节都与趋化因子及其受体密切相关。
趋化因子(chemokine)，也称趋化激素或化学激素，是一类由不同类型的细胞分泌的、能使细胞发生趋化运动的、对免疫细胞具有趋化作用、相对低分子质量(8～12 kD)的小分子细胞蛋白家族。趋化因子受体是能够特异性结合趋化因子的细胞膜蛋白，属于七次跨膜的G蛋白偶联受体家族，并选择性地表达在靶细胞表面。趋化因子与其受体结合，启动或调节相关的信号传导，参与各种生理、病理过程。
趋化因子CXCL12，又称基质细胞衍生因子-1(SDF-1)，是骨髓基质细胞产生的CXC类趋化蛋白，有两种主要形式:SDF-1α和SDF-1β，是已知唯一能与受体CXCR4结合并能激活它的趋化因子。SDF-1广泛地表达于多种细胞和组织中，包括免疫细胞、肺、肾、脑、心脏等，是调节B淋巴细胞、造血干细胞生成及淋巴细胞迁移的关键因子。趋化因子SDF-1对淋巴细胞有强烈的趋化作用并在发育中起着重要的作用。在胚胎发育中，SDF-1诱导造血干细胞从胎儿肝脏到骨髓的迁徙。在SDF-1缺失的小鼠，其早期胚胎的心脏及大脑发育异常。
SDF-1通过与CXCR4结合介导肌动蛋白聚合，启动下游信号通路，引起MEK/ERK磷酸化和胞内游离的钙离子增加。同时，通过形成伪足、调控肿瘤细胞表面某些黏附因子的表达或活性等方式，从而参与形成肿瘤迁移(migration)和转移的有利微环境，进而调控肿瘤细胞的生长、存活、转移及肿瘤新生血管形成。
CXCR7是SDF-1新发现的另一个受体，与SDF-1结合能力比CXCR4更强。由于CXCR7缺乏趋化因子受体典型的G蛋白偶联受体序列，故SDF-1活化CXCR7后，并不能引起细胞钙流变化和细胞迁移，也不会激活细胞内促分裂原活化蛋白激酶(MAP)或PI1激酶/PKB等级联信号通路。Ulrike Naumann等发现，CXCR7能清除其配体SDF-1(CXCL12)及I-TAC(CXCL11)，降低其浓度。在斑马鱼及哺乳动物细胞，无论配体是否存在，CXCR7都不断的在质膜与细胞质之间的循环。有观点认为，SDF-1与诱饵受体CXCR7结合后，并不激活典型的G蛋白信号通路，却能通过β-arrestin激活促分裂原活化蛋白激酶(MAP)。利用CXCR7拮抗剂或β-arrestin siRNA可显著地减弱内源性表达CXCR7的血管平滑肌细胞的迁移。可见，介导CXCR7信号通路的是β-arrestin，CXCR7是一个独立的β-arrestin受体。
虽然，目前对CXCR7的具体功能尚未研究确切，但其在免疫、肿瘤以及血管生成中所发挥的重要作用毋庸置疑的。CXCR7能促进癌细胞的存活，低表达CXCR7的野生型MDA-MB-435s乳腺癌细胞难以在低血清(1％FBS)培养基中存活，而转染CXCR7质粒的MDAMB-435s细胞却能在同样条件下存活，进入对数生长期。Wang等发现，CXCR7在前列腺癌中高度表达。高密度组织染色微数列显示，在侵袭性较强的肿块，CXCR7蛋白的表达量更多。CXCR7的表达促进癌细胞的黏附、侵袭、增殖及存活，CXCR7对多种参与肿瘤侵袭的分子的表达都有影响，如CD44、钙黏着蛋白-11(CDH11)、IL-8、血管内皮生长因子、TGF-β。基于CXCR7的功能多样性，特异性阻断CXCR7有望成为癌症治疗的新策略。一些小分子抑制剂如CCX733、CCX266、siRNA及封闭性抗体已经应用在体内、外实验研究中。但总的来说，CXCR7的表达调控机制、介导生物效应的信号通路尚未研究清楚，有待更进一步的深入研究。
本课题组曾对SDF-1进行基因改造，获得一种CXCR4竞争性拮抗剂:SDF-1/54R，并证实SDF-1/54R可诱导CXCR4内吞，使细胞膜表面CXCR4迅速消失，随之由CXCR4介导的肿瘤细胞迁移受到抑制，并且不激活由其介导的下游信号通路，表现出很好的抗癌作用。但由于获得的SDF-1/54R蛋白为无生物活性的包涵体，虽较易获得大量的包涵体蛋白，但后期变性、复性操作繁琐，活性蛋白得率也较低。
基于SDF-1新受体CXCR7的发现和本课题组对SDF-1/54R的前期研究结果，我们推测SDF-1突变体SDF-1/54R也是一种CXCR7特异性拮抗剂，能够竞争性抑制SDF-1/CXCR7介导的乳腺癌增殖与转移。为验证该假说，本课题拟利用基因工程技术更换SDF-1突变体SDF-1/54R的表达载体，以获得可溶表达的目的蛋白SDF-1/54R。同时，通过流式细胞术筛选到高表达CXCR7的乳腺癌细胞，并利用该细胞考察获得的SDF-1/54R蛋白对CXCR7介导的乳腺癌细胞增殖和转移的抑制作用，为将SDF-1/54R开发成以CXCR7的靶点的新型多肽类抗癌药物奠定必要的前期工作基础。
二、目的
利用基因工程技术更换SDF-1突变体SDF-1/54R的表达载体，以获得可溶表达的目的蛋白SDF-1/54R，并通过体外实验证实SDF-1/54R对SDF-1/CXCR7介导的乳腺癌细胞增殖和转移的抑制作用。
三、研究方法
1、流式细胞术筛选高表达CXCR7的乳腺癌细胞培养:各种乳腺癌细胞包括MCF-7、MDA-MB-231等，待生长状态良好后胰酶消化，收集细胞后用PBS洗涤1次、调整细胞浓度。再将细胞重悬于200μL的PBS中，制成单细胞悬液，并分成体积相等的两组。其中，实验组加入1μLCXCR7一抗，混匀后4℃孵育;30min后用PBS充分洗涤细胞2次，重悬细胞于100μL的PBS中，加入0.5μL FITC标记的羊抗兔抗体，对照组加入0.5μLFITC标记的羊抗兔抗体，混匀后4℃孵育;30min后用PBS充分洗涤细胞2次，重悬细胞于200μL的PBS中，流式细胞仪检测细胞表面的CXCR7的表达。
2、SDF-1/54R/pET-41a+的构建、表达及纯化:为获得可溶表达的SDF-1/54R蛋白，以SDF-1/54R/pET-30a+质粒为模板，设计引物，PCR扩增SDF-1/54R基因，PCR产物双酶切后连接至载体pET-41a+，构建重组载体SDF-1/54R/pET-41 a+。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)，经化学诱导剂IPTG诱导后，表达产物通过SDS-PAGE检测。然后通过优化表达条件，如IPTG浓度、诱导温度、时间等，确定最佳表达条件后大量制备SDF-1/54R蛋白。
采用GST亲和层析系统纯化可溶表达的融合蛋白。还原型谷胱甘肽沈脱液洗脱，收集目标蛋白，SDS-PAGE检测。检测正确后，对纯化得到的融合蛋白溶液进行透析，以满足后续酶切条件。参考肠激酶说明书，预实验确定最佳酶切反应体系、时间、温度、浓度等条件，切除重组融合蛋白N端的GST-tag，并再次利用GST亲和层析系统对酶切产物进行二次分离纯化。收集洗脱下来的目的蛋白SDF-1/54R，SDS-PAGE检测分析。
3、SDF-1/54R的活性检测:利用细胞实验模型对SDF-1/54R的体外活性进行检测。首先利用已筛选到的CXCR7高表达的乳腺癌细胞MCF-7，通过流式细胞术检测SDF-1/54R诱导细胞表面受体CXCR7内化的能力，然后利用MTT法检测SDF-1/54R对CXCR7的乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用。趋化实验考察SDF-1/54R对CXCR7介导的细胞转移的抑制效应。
四、结果
1、流式细胞术筛选高表达CXCR7的乳腺癌细胞:利用流式细胞仪检测乳腺癌细胞表面CXCR7的表达，结果发现，CXCR7在乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中高表达，其表达量分别为68.64％和66.13％，CXCR7在乳腺癌细胞4T-1中不表达。
2、SDF-1/54R/pET-41a+的构建、表达及纯化测序:结果表明，重组表达载体SDF-1/54R/pET-41 a+构建成功，转化大肠杆菌BL21(DE3)中，成功表达了可溶性融合蛋白GST-SDF-1/54R。在最佳条件下大量表达重组融合蛋白GST-SDF-1/54R，并经过优化纯化、透析、肠激酶酶切等相关技术路线，最后分离、纯化出较高纯度的目的蛋白SDF-1/54R。
3、SDF-1/54R的活性检测:利用流式细胞仪检测发现，SDF-1/54R能够显著降低MCF-7细胞膜表面CXCR7的表达。MTT法结果表明SDF-1/54R能在48小时内显著抑制CXCR7介导的乳腺癌细胞MCF-7的增殖。趋化实验表明SDF-1/54R能够竞争性抑制SDF-1/CXCR7诱导的MCF-7细胞的跨膜转移。
五、结论
1、检测的乳腺癌细胞中MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞表达CXCR7，其中MCF-7细胞表达量最高，达69.99％。
2、成功利用原核表达系统，表达出可溶性GST-SDF-1/54R融合蛋白，为获得大量有活性的SDF-1/54R蛋白奠定基础。在成功表达后，优化条件，制备去掉GST标签的、具备生物活性的可溶性目的蛋白SDF-1/54R蛋白。
3、SDF-1/54R能够诱导乳腺癌细胞MCF-7膜表面CXCR7的内在化消除，并显著抑制CXCR7介导的细胞增殖和转移，是一种良好的CXCR7特异性拮抗剂。为其进一步的功能研究和体内活性实验奠定了前期工作基础。
乳腺癌;趋化因子;侵袭转移;新生血管
南方医科大学
硕士
病原生物学
龙北国;马伟峰
2013
中文
R737.9
72
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）