二型真菌形态转换相关非编码RNA表达谱的研究
非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)是一类在生物体中广泛存在的且不编码蛋白质的功能性RNA分子，直接在RNA水平发挥作用，影响生物体的生命活动。动植物ncRNAs的研究已有大量的文献报道，而真菌ncRNAs的研究报道则相对较少。白色念珠菌（Candida albicans，C.albicans）作为一种主要的人体侵染性致病真菌，在免疫功能低下的个体中极易引起各种感染和病症。响应周围环境的变化而改变自身的生长形态，实现酵母形态、假菌丝形态及菌丝形态之间的可逆转换是C albicans的显著特性之一，对于C.albicans的致病性也至关重要。本课题以酵母型和菌丝型C.albicans菌株为研究对象，分别构建其小非编码RNA(small non-coding RNA，sncRNA)转录组深度测序文库，采用Hiseq2000测序系统进行测序。通过生物信息学技术和方法，本文对其sncRNA表达谱进行了比较分析，并探讨了其分子生物学特性。现将研究结果小结如下:
1、利用含10％血清的1640液体培养基在37℃下分别诱导C.albicans野生型SC5314菌株及非致病型2.538菌株菌丝的发生。在经过对培养时间、细胞状态及细胞密度等因素的反复试验并调整后，最终将两种不同菌株的酵母型细胞均诱导成为了具有典型真菌丝形态特征的C.albicans菌丝型细胞，构建了稳定诱导二型真菌C.albicans菌丝发生的方法体系。结果显示:菌浓度保证在105数量级的单细胞状态C.albicans细胞培养3h后能形成大量具有经典菌丝形态的菌丝型细胞。
2、基于传统热酸性酚提取真菌总RNA的方法，在酚与菌体细胞混合时加入适量无RNA酶瓷珠一同混匀，再水浴高速振荡，以增强破壁效果，使RNA从细胞中迅速释放。琼脂糖凝胶电泳和Agilent2100的检测结果表明:在4个样品（即SC5314菌株及2.538菌株的酵母型与菌丝型细胞样品各一个）中加入了无RNA酶瓷珠一同振荡提取获得的总RNA在数量和质量上都得到了保证。
3、采用割胶回收的方法分别从四个总RNA样品中分离18-40 nt的小RNA分子用于小RNA文库构建并测序。测序数据的分析结果显示:实际有效的小RNA分子长度区间为14-44 nt，不仅包括了18-40 nt的小RNA分子，小于18 nt或大于40 nt的小RNA分子也在其中，说明割胶回收法具有高效分离小RNA分子的优点。
4、本课题采用HiseqTM2000测序系统对四个小RNA文库进行测序。在去除了四个小RNA原始测序数据中无效的或低质量的reads及接头等后，每个样品中均获得了约99％的高质量clean reads。4个样品总计达128636135条小RNA高质量clean reads。
5、以SC5314 Assembly21基因组为参考，利用Bowtie0.12.7在允许2个错配的条件下将小RNA高质量clean reads映射到参考基因组上。结果显示:4个样本平均约74.8％的高质量clean reads映射到rDNA位点上。映射到tDNA的位点上的高质量clean reads在4个样品中分别约为4.5％，8.9％，5.5％和33.0％。其余映射到基因组上的高质量clean reads则主要分布于已知编码基因（ORF）与已知的ncRNAs类群（如反转座子）上。最终只有不到6％的高质量clean reads无法映射到参考基因组上。
6、所有映射于基因组上的高质量clean reads的长度与种类分布特征分析结果显示:这些小ncRNAs主要富集于19-34 nt的长度范围内，其中以22 nt小ncRNAs的丰度最高。另外，在26-34nt的长度范围内，两个菌丝型细胞样中的小ncRNAs丰度均比相应的酵母型细胞样中的要高些，提示分布于这一长度区间的某些小ncRNAs可能与C.albicans的形态转换有关。
7、利用生物信息学方法对映射于已知ncRNAs类群上的小ncRNAs的分析结果显示，4个样品中均以来源于反转座子的ncRNAs占绝大多数。此外，对4个样品中这些反转座子上的ncRNAs的特征分析结果表明:5'末端为A或U的22 nt小ncRNAs在这类小ncRNAs中最为丰富。这一结果与SC5314菌株中已报道过的小ncRNAs的特征是一致的，说明了本课题测序数据是可靠的。
8、对4个样中rRNA和tRNA来源的小ncRNAs的分布特征分析结果显示:这两类小ncRNAs均主要集中分布于19-36 nt长度区间，其中源于rRNA的小ncRNAs在23 nt位置出现最高峰;而源于tRNA的小ncRNAs则在34 nt位置具有最高峰值。
9、运用microRNA预测软件miRDeep2在严格的默认参数设置下预测C.albicans中可能的microRNA候选物。在SC5314酵母型细胞中预测到2个microRNA候选物;在SC5314菌丝型细胞中预测到1个microRNA候选物;在2.538酵母型细胞中预测到8个microRNA候选物;在2.538菌丝型细胞中预测到6个microRNA候选物。并且4个样品中同时预测到了1个共有的microRNA候选物。
10、利用Cufflinks软件包分析酵母型与菌丝型样品间ncRNAs表达谱的差异，寻找与C.albicans形态转换相关的ncRNAs。在SC5314菌株中检测到21个与形态转换有关的已知ncRNA;在2.538菌株中检测到60个与形态转换有关的已知ncRNA。两种菌株中同时检测到与形态转换有关的ncRNA共有17个。
二型真菌;白色念珠菌;非编码RNA;高通量测序;表达谱;菌丝形态特征
南昌大学
硕士
微生物学
李思光
2013
中文
Q949.32;Q522.6
70
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）