西氏鲍与皱纹盘鲍杂交子代抗逆性分子机制的初步研究
在鲍遗传育种工作中，杂交是一种行之有效的改良养殖种质的手段，通过杂交获得的杂种后代，与亲代相比往往具有生长快、存活率高、抗逆性强等方面的杂种优势。为研究这种杂种优势的分子机制，本研究以西氏鲍（Haliotis gigantea）(GG)、皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）(DD)及其正交F1代群体(DG)和反交F1代群体(GD)为研究对象，探讨了它们在应对温度骤变、短期温度胁迫和病菌胁迫等不利环境时，一些耐热及免疫相关分子指标的变化和差异，以期初步了解鲍种间杂种优势的分子机制，同时试图筛选可能用于鲍育种实践的分子指标。
利用RACE技术从西氏鲍（Haliotis gigantea）中克隆到了热休克蛋白70(HSP70)、热休克蛋白90(HSP90)和铁蛋白(Ferritin)的核苷酸全长序列，从皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）中克隆到了冷休克结构域蛋白(CSDP)的核苷酸全长序列。其中西氏鲍HSP70、HSP90和Ferritin的全长分别为2449bp、2608bp和909bp，分别编码448、501和117个氨基酸;皱纹盘鲍CSDP的全长为1468bp，可编码202个氨基酸。由核苷酸序列推断出的西氏鲍HSP70、HSP90、Ferritin和皱纹盘鲍CSDP的氨基酸序列，各自均具有其家族的标志性序列。氨基酸序列的同源性比对显示，西氏鲍HSP70、HSP90和Ferritin的氨基酸序列与其它贝类的HSP70、HSP90和Ferritin高度相似，皱纹盘鲍CSDP的氨基酸序列的保守区(CSD)序列与其它水生动物的CSDP保守区氨基酸序列高度相似。
以半定量PCR为手段研究了在梯度温度应激下，HSP70和HSP90在四群体中的表达情况。实验结果表明，在非应激温度下，GG具有最高的HSP70和HSP90水平;在应激温度下，DD的HSP70和HSP90水平呈现先上升后下降的趋势，GG、DG和GD的HSP70和HSP90水平均随温度上升而上升;在相对高温的30℃条件下，DD的HSP70和HSP90水平显著低于其它三个群体。结果表明，DG和GD明显地继承了GG的耐高温能力，表现出杂种优势或中亲优势。
将四个群体分别置于低温(12℃)和高温(28℃)下进行持续7天的短期胁迫，在胁迫的开始和结束时（1天和7天）分别测定四个群体的免疫参数指标（总血细胞数THC，呼吸爆发RO，四种溶酶体酶SOD、ACP、AKP和MPO的活力）及耐热性评价指标(HSP70)的水平。结果表明，在不同取样时间点，鲍的整体THC水平在28℃下均有显著上升，且DG和GD的整体THC水平要显著高于DD和GG; RO水平和SOD活力在不同群体间没有显著差异，28℃下，RO水平显著地增加，而SOD活力则呈现先上升，后下降的趋势;AKP活力在12℃和28℃下均有显著提高（第1天），且DG的整体AKP水平要显著高于其它三个群体;而ACP活力在7天的胁迫过程中没有显著变化;MPO活力能够被12℃和28℃显著抑制（第1天），而在第7天恢复本底值，且DG和GD的整体MPO活力显著低于DD和SS（第1天），而在第7天时各群体间的MPO水平没有显著差异;四个群体的整体HSP70的表达均能被高温显著诱导，DD的HSP70水平在高温胁迫的第1天急剧增加，而在第7天又急剧下降，GG、DG和GD的HSP70水平则在7天的高温胁迫过程中缓慢上升。实验的结果表明，所选用的免疫参数均能被高低温显著影响;在不同温度条件下，DG和GD的免疫指标水平和HSP70水平或是高于DD，或是在面对胁迫时波动不明显，预示着相对于DD，杂交群体在胁迫温度下有着更强的耐热力和更高的免疫系统效率。
以哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）三株弧菌的混合菌为侵入菌，分别对四个群体进行常温(20℃)和高温(28℃)下的攻毒，并观察四个群体在攻毒后48h内的存活率差异;同时以半定量PCR法研究了常温(20℃)攻毒后，四个群体的两种组织（鳃和血淋巴）内的三种免疫相关基因:HSP70、CSDP和Ferritin在48h内的表达规律及差异。存活率实验表明，在常温下四个群体均没有出现死亡的情况，而在高温下四个群体均出现了明显的死亡:在48h时，DD群体全部死亡;在12h到48h的时间内，GG、DG和GD三群体的存活率均高于DD群体。半定量PCR结果显示，HSP70在鲍的鳃和血淋巴中均有显著上调，且呈现时间依赖性，分别在攻毒后的48h和12h时达到最高值，且GG、DG和GD三个群体的整体HSP70水平要显著高于DD群体;CSDP在鲍的鳃组织中表达规律呈明显的时间依赖性，在48h时达到最高值，并且DD群体的CSDP水平显著低于其它三个群体;Ferritin在鲍的鳃组织和血淋巴中均随病菌胁迫表现出规律性的上调，但总体上在四个群体间没有显著差异。以上实验结果表明，DG和GD已经通过杂交继承了GG的强抗病力，通过杂交实现了对皱纹盘鲍的种质改良。
西氏鲍;皱纹盘鲍;抗逆性;遗传育种;杂种优势;分子机制;杂交子代
厦门大学
硕士
海洋生物学
柯才焕
2013
中文
S944.45
112
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）