尼古丁对Raw264.7和EL4细胞增殖及凋亡作用的研究
尼古丁作为α7乙酰胆碱受体激动剂能够有效调节细胞增殖和活性。近期，Gergalova等研究发现，α7烟碱型乙酰胆碱受体不仅表达在细胞质膜上调控细胞的增殖和存活，同时也在线粒体外膜上调节细胞色素C(Cyt C)释放。而细胞色素C的释放作为凋亡信号传导的重要因素，是目前研究的热点。各种凋亡刺激信号通过BH3(Bcl-2 homology domain3)-only蛋白引起Bax(Bcl-2-asslciated proteinX)蛋白转位到线粒体外膜上并多聚化，形成膜通道，刺激线粒体释放细胞色素C，从而引起细胞凋亡。
本课题采用Raw264.7和EL4细胞系分别探究尼古丁刺激对其增殖能力和生存活性的影响。首先以CCK-8细胞增殖实验、Western blot分别检测不同浓度和时间梯度下尼古丁对Raw264.7和EL4细胞增殖能力和凋亡情况的影响。继而以CCK-8、Western blot检测α7 nAChR在尼古丁促增殖抗凋亡中的作用。再通过线粒体分离试验结合Western blot分别检测线粒体和细胞质中Bax和细胞色素C的表达变化。此外，以Westemblot检测尼古丁对Erkl/2、p38、SAPK/JNK、PI3K-AKT信号通路的激活情况及对抗凋亡蛋白Bcl-2、、Mcl-1的表达影响。最后，结合各信号通路抑制剂的使用以Annexin V-APC/PI流式细胞术探讨尼古丁拮抗顺铂诱导Raw264.7和EL4细胞凋亡的分子机制。
结果显示:首先，10-7mol/L的尼古丁作用24小时具有明显的促增殖抗凋亡作用;α7乙酰胆碱受体特异性拮抗剂BTX可使Raw264.7和EL4细胞增殖率分别降低26.9％和17％，而α7乙酰胆碱受体非特异性拮抗剂TC的作用使Raw264.7和EL4细胞增殖率分别降低33.4％和26.5％;同时，BTX和TC可明显降低Caspase3活性剪切片段(17kDa/19kDa)的表达，即尼古丁通过α7乙酰胆碱受体发挥促增殖抗凋亡作用。其次，10-7 mol/L尼古丁作用24小时可明显引起细胞质中Bax表达量上调而细胞色素C表达量下调，相反，线粒体中Bax表达量下调而细胞色素C表达量上调，有效逆转凋亡诱导剂顺铂的作用。此外，10-7 mol/L的尼古丁作用5-60分钟不仅可不同程度地激活Erkl/2、p38、SAPK/JNK、PI3K-AKT信号传导通路也可增加抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1的表达。最后，结合LY294002、Wortmanin、U0126、SB203580、SP600125通路抑制剂的使用，发现LY294002和Wortmanin分别将尼古丁对Raw264.7细胞的增殖作用降低45.2％、79.1％，对EL4细胞的增殖作用降低64.5％、83.1％;而U0126、SP600125、SB203580拮抗尼古丁的作用使Raw264.7细胞的凋亡率分别增加48.1％、33.1％、12.35％，EL4细胞的凋亡率分别增加49.65％、42.28％、41.18％。
综上所述，尼古丁发挥促增殖作用是通过上调α7 nAChR的表达与PI3K-AKT通路相关。而抗凋亡作用则是通过调控位于线粒体外膜上的α7nAChR进而调控胞质中Bax转位和细胞色素C释放，与MAPK通路相关。本课题以线粒体中烟碱受体的存在最初探讨了尼古丁抑制肿瘤细胞凋亡的机制，为线粒体凋亡保护作用提供了一个较新颖的视角，同时也为药理学研究提供了新的方法。
尼古丁;细胞色素C;α7乙酰胆碱受体激动剂;细胞增殖;分子机制
厦门大学
硕士
药理学
陈有海;高丰光
2013
中文
R329.28
67
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）