miR-148a在膀胱癌组织中的异常表达及初步临床意义探讨
目的：
采用Trizol提取膀胱上皮移形细胞癌(TCCB)及正常膀胱粘膜组织(NBE)的总RNA，采用实时荧光定量PCR方法检测miR-148a在TCCB组及NBE组织中的相对表达量，分析比较miR-148a在两组间的相对表达量是否有显著性差异，并进一步结合临床资料来分析TCCB组不同病理分级之间以及不同临床分期组之间miR-148a的相对表达量是否具有统计学意义。对miR-148a在膀胱癌组织中的临床意义进行初步探讨，并为进一步研究miR-148a在膀胱癌发生发展过程中可能的作用机制奠定基础。
方法：
1.从2011年到2012年，采集温州医学院附属第一医院及浙江大学附属浙二医院泌尿外科诊疗中心膀胱肿瘤患者标本，按照膀胱癌临床诊断标准收集BCa组织66例为实验组，经病理证实均为膀胱上皮移形细胞癌(TCCB)，以及外伤性膀胱破裂患者正常膀胱粘膜组织18例为对照组，经病理证实均为正常膀胱粘膜组织(NBE)。标本取得后迅速冷冻于液氮中，随后放置于-80℃低温冰箱中储存备用。
2.采用美国Invitrogen公司的TRIzol(@) Reagent Kit对膀胱癌组织和正常对照粘膜组织进行总RNA的抽提，流程步骤为:组织匀浆、分离相、RNA沉淀、RNA洗涤和RNA溶解。操作过程严格按照原装试剂盒的说明书进行操作。采用Thermo NanoDrop2000分光光度计（美国Thermo公司）对总RNA浓度及纯度进行检测。
3.采用美国ABI(Applied Biosystems)公司的TaqMan(@) MicroRNA Reverse Transcription Kit试剂盒及TaqMan(@) MicroRNA Assays的特异性引物miRNA-specific RT primer进行逆转录过程，把总RNA逆转录成cDNA，整个准备过程需要在冰上操作。使用美国ABI公司的stepone plus实时荧光定量PCR仪进行逆转录反应过程，反应条件为:16℃30min;42℃30min;85℃5min;4℃∞。逆转录后的产物直接用于PCR扩增过程。
4.采用美国ABI公司的TaqMan(@)MicroRNA Assays试剂盒进行PCR扩增过程:PCR反应体系需要加入TaqMan(@) MicroRNA Assays的上下游引物及探针miRNA-specific forward PCR primer, reverse PCR primer和Taqman MGB probe的混合物，内参U6和miR-148a的逆转录引物，以及TaqMan(@) UniversalMaster MixⅡ(No UNG，即不含尿嘧啶-N-糖苷酶)。反应体系所有试剂需要在冰上准备，整个体系不能有气泡存在。扩增过程利用美国ABI公司的stepone plus型实时荧光定量PCR仪进行，扩增循环参数如下:95℃，10mins;95℃，15s，60℃，60s，一共40个循环。
5.扩增结束后适当调整基线，扩增曲线与基线的交叉点即为Ct值(Cycle threshold))。根据各样本miR-148a和所对应U6的Ct值，采用相对定量方法计算原组织标本中miR-148a的相对表达量，结果表示为2-△Ct(△Ct=CtmiR-148a-CtU6)。
6.用SPSS17.0软件对数据进行统计学分析:各分组相对表达量呈偏态分布用中位数（四分位数）表示，不同膀胱组织类型miR-148a的表达差异用完全随机设计两样本比较的Mann-Whitney U检验;TCCB组中不同病理分级间的差异用Kruskal-Wallis H秩和检验;TCCB组不同临床分期(Tis+T1)和(T2+T3+T4)间的差异用两个独立样本比较的Mann-Whitney U检验，均设p＜0.05为差异有统计学意义。
结果:
1.TCCB组织及NBE组织的RNA浓度测定:所有样品A260/A280在1.8-2.0之间，RNA纯度较高，无DNA、蛋白质等污染，可以为下游实验提供合格样本。
2.用ABI stepone plus型实时荧光定量PCR仪对TCCB组与NBE组进行miR-148a的相对表达量的检测，经两独立样本Mann-Whitney U检验统计学方法对数据作统计，结果显示:TCCB组中miR-148a的相对表达量明显低于NBE组，统计有显著性差异，z值为-5.22(p＜0.001)。
3.对miR-148a在膀胱癌诊断中进行效能评估，发现miR-148a对于膀胱癌诊断的特异性非常高，达到94.4％，阳性预测值为97.87％。使用Pearson卡方检验再次验证miR-148a的表达在膀胱癌组织和正常组织中是否存在差异，同时检测OR值进行风险评估。结果显示:x20.05,1=23.609，P＜0.001，OR=39.1(4.87～314.23)，也就是说miR-148a相对表达量＜0.018时发生TCCB的概率为＞0.018时的39倍，具有非常明显的临床意义
4.用多个样本Kruskal-Wallis H秩和检验统计学方法对TCCB组不同病理分级（Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级）中的miR-148a相对表达量的差异性做组间分析。经统计学比较三个组别之间差异无统计学意义(x20.05,1=2.66，P＞0.05)。
5.在TCCB不同临床分期组(T2+T3+T4)和（Tis原位癌+T1）之间经Mann-Whitney检验统计学方法比较，两组之间差异无统计学意义，Z=-0.60，P值＞0.05。
结论:
我们的研究结果显示，利用实时荧光定量PCR法定量检测TCCB及NBE组织中miR-148a的相对表达量，以NBE组为对照，miR-148a在TCCB组中的表达是明显降低的。对miR-148a在膀胱癌诊断中进行效能评估，发现miR-148a对于膀胱癌诊断的特异性非常高，达到94.4％，阳性预测值为97.87％。用卡方检验对OR值进行风险评估，得出miR-148a相对表达量＜0.018时发生TCCB的概率为＞0.018时的39倍，具有非常明显的临床意义。此外发现miR-148a的表达在膀胱癌组中不同病理分级（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级）之间以及不同临床分期组之间均没有显著性差异，提示miR-148a可能在膀胱癌的发生和发展过程中起着抑癌基因的作用。为miR-148a在BCa肿瘤形成及肿瘤治疗方面提供了新的视点。接下去我们的思路将继续收集不同分级的癌组织标本，找出miR-148a在膀胱癌中的关键靶基因，继续探讨其在BCa中的发病机制，以及与肿瘤侵袭和淋巴结转移的关联，论证miR-148a可以作为抑制肿瘤转移的潜在的治疗靶点的可行性。并有望进一步为BCa的诊断、预后判断及基因治疗提供相应的指标及靶点。
膀胱上皮移形细胞癌;实时荧光定量PCR法;miR-148a基因;基因治疗
温州医科大学;温州医学院
硕士
临床检验诊断学
陶志华
2013
中文
R737.14;R730.21
51
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）