WNK1激酶和WNK4激酶对肾脏钙激活钾通道的调节作用及机制研究
一种最新发现的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，因在其功能结构域中缺乏与磷酸化过程密切相关的赖氨酸而被命名为WNK激酶(with no lysine(K) kinase)。目前在这个家族共发现4个亚型，即WNK1-WNK4，其中WNK1激酶有两种亚型，全长WNK1(即full-length WNK1，简称L-WNK1)以及肾脏特异性WNK1(简称KS-WNK1)。据报道L-WNK1激酶和WNK4激酶的基因突变可引起假性醛固酮减少征Ⅱ型（PHAⅡ），该疾病又称为Gordon综合征，是一种少见的常染色体显性遗传性疾病，以高血压、高钾血症、高氯血症、代谢性酸中毒为典型的临床表现，但该疾病患者的肾功能正常。多项研究表明，WNK激酶是肾脏中多个离子转运体和离子通道的上游调控蛋白，这些研究提示WNK激酶可能参与了一种尚未被发现的信号通路的构成。此外，该激酶家族还参与维持机体电解质平衡和血压调控。肾脏远端肾单位中有两种主要的钾离子通道即ROMK和Maxi K，以往普遍认为ROMK通道对肾脏钾分泌起着主要作用，新的证据则表明在肾脏中除了ROMK外Maxi K通道对于钾的分泌也有重要作用。Maxi K即钙激活钾通道（Calcium ActivatedPotassium Channel），又可称为BK通道或Slo1，已经证实Maxi K参与高血压的发病机制并且在维持电解质平衡中起到重要作用。Maxi K通道蛋白由Slo1基因编码，该通道广泛分布于除心肌细胞以外的各种不同的组织细胞中，如肾小管上皮细胞、神经细胞，尤其在血管平滑肌上分布丰富。在血管平滑肌细胞(SMC)， Maxi K通道被激活而产生的钾离子电流是减少电压依赖性钙离子内流的超极化因素。当Maxi K通道被特异性抑制剂所阻断后可引起平滑肌细胞收缩，导机体致血压升高，这表明Maxi K通道也参与维持平滑肌细胞的静息膜电位。前期研究显示，WNK4-WT能显著抑制Maxi K的表达，而L-WNK1则可能上调Maxi K的表达。另外有报道提示WNK激酶与MAPKs信号通路密切相关，在上述实验的启发下，本实验研究在HEK-293T细胞内L-WNK1对Maxi K的调节作用及其可能的调节机制，以及WNK4-WT与L-WNK的相互作用及它们对Maxi K表达的调节作用。
目的:
1.观察L-WNK1对Maxi K通道在Cos-7细胞上分布的调节作用。
2.研究在HEK-293T细胞中L-WNK1对Maxi K通道总蛋白水平表达的调节作用。
3.研究在HEK-293T细胞中L-WNK1对Maxi K通道总蛋白表达的调节机制。
4.研究在HEK-293T细胞中WNK4-WT和L-WNK1的相互作用及它们对MaxiK通道总蛋白表达的调节作用。
方法:
1.应用细胞免疫荧光法及荧光显微镜观察正常情况下Maxi K在Cos-7细胞上的分布，以及L-WNK1对Maxi K通道在Cos-7细胞上分布的调节作用。
2.应用Western Blot方法研究在HEK-293T细胞中L-WNK1对Maxi K通道总蛋白表达水平的调节作用。
3.应用Western Blot方法研究在HEK-293T细胞中L-WNK1是否可使p-JNK1/2表达增加，进而探讨L-WNK1对Maxi K通道总蛋白表达的调节机制。
4.应用Western Blot方法验证在HEK-293T细胞中L-WNK1和WNK4-WT分别对Maxi K通道总蛋白表达的调节作用，并进一步研究当L-WNK1和WNK-WT的相互作用及它们对Maxi K通道总蛋白表达的调节作用。
结果:
1.通过细胞免疫荧光法及荧光显微镜观察发现，CD4对照组中Maxi K同时分布于Cos-7细胞膜表面和细胞浆内;L-WNK1组中Maxi K通道在胞浆内及胞膜表面分布明显增多。
2.Western Blot方法提示与vector对照组相比，L-WNK1组Maxi K通道的总蛋白表达量显著上调，且随着L-WNK的DNA量逐渐增加，其上调作用逐渐加强，显示出剂量依赖性。
3.Western Blot方法提示与vector对照组相比，L-WNK1组p-JNK1/2的表达量显著上调，且随着L-WNK的DNA量逐渐增加，其上调作用逐渐加强，显示出剂量依赖性。
4.Western Blot方法提示与对照组相比，L-WNK1组Maxi K通道的总蛋白表达量显著增加，WNK4-WT组Maxi K通道的总蛋白表达量显著减少，L-WNK1+WNK4-WT组Maxi K通道的总蛋白表达量与L-WNK1组相比显著减少，与WNK4-WT组相比显著增加。
结论:
1.在Cos-7细胞中，Maxi K通道主要分布于细胞膜表面和细胞浆内，L-WNK1激酶增加Maxi K在细胞膜表面和细胞浆内的分布。
2.L-WNK1激酶能上调Maxi K通道在HEK-293T中的总蛋白表达水平，且其上调作用为剂量依赖性。
3.L-WNK1激酶上调Maxi K通道在HEK-293T中的总蛋白表达水平可能是通过磷酸化JNK1/2这调信号传导通路实现的。
4.在HEK-293T中，L-WNK1激酶与WNK4-WT激酶对Maxi K通道总蛋白表达的调节具有拮抗作用。
L-WNK1激酶;钙激活钾通道;调节作用;血管平滑肌细胞;发病机制
温州医科大学;温州医学院
硕士
内科学(肾脏病)
蔡晖
2013
中文
R692
53
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）