5-氟尿嘧啶诱导脂多糖激活的巨噬细胞凋亡的研究
目的:
1.研究不同浓度5-氟尿嘧啶(5-FU)对脂多糖(LPS)激活的SD大鼠腹腔巨噬细胞的生长的抑制作用;
2.研究Bcl-2（B淋巴细胞瘤-2）、Bax（Bcl-2相关X蛋白）mRNA及蛋白表达及Caspase-3（半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3）活性、蛋白表达在不同浓度5-FU作用于受LPS激活的巨噬细胞的表达量变化;
3.研究5-FU对LPS激活的巨噬细胞凋亡作用与P53通路关系，探讨其可能的作用机制。
方法:
1.自SD大鼠腹腔提取巨噬细胞，倒置显微镜观察细胞形态、瑞氏染色做细胞鉴定及台盼蓝染色测定其活力;LPS(1μg/ml)刺激大鼠巨噬细胞建立体外炎症模型;
2.设置空白对照组、LPS（1μg/ml）组、LPS+5-FU(0.01、0.1、0.5、1、5、10mM)组，共同孵育24小时。采用细胞计数CCK8试剂盒(CCK8)检测细胞活性。
3.设置空白对照组、LPS组、5-FU（0.5mM）组、LPS+5-FU(0.5mM)组，孵育12h后，经Hoechst染色后，荧光显微镜观察凋亡细胞的形态4.设立空白对照组、LPS组及LPS+5-FU（0.1、0.5、1、5mM）组，置培养箱中培养分别12h、8h、6h后，采用Caspase-3活性检测试剂盒检测各时间段Caspase-3的活力。
5.设空白对照组、LPS组及LPS+5-FU(0.1、0.5、1、5mM)组，培养12h后Trizol法提取总RNA，实时荧光定量PCR(Realtime-PCR)检测Bcl-2、Bax及P53基因的表达。
6.设空白对照组、LPS组及LPS+5-FU(0.1、0.5、1、5mM)组，培养12h后，蛋白质印迹(Western blot，WB)测定Bcl-2、Bax、p-Caspase-3（磷酸化Caspase-3）及P53/p-P53（磷酸化P53）蛋白表达。
结果:
1.细胞形态观察及鉴定结果:倒置显微镜下，巨噬细胞状态良好可见较多细胞伪足，细胞呈圆形或椭圆形。瑞氏染色可见巨噬细胞胞核呈紫红色，胞核形态多样，呈卵圆形、肾形或马蹄形，核常偏位;胞浆呈蓝紫色或细小淡红色。台盼蓝染色显示其活力＞95％。
2.CCK-8检测结果:显示与LPS组相比，不同浓度5-FU对受LPS刺激的巨噬细胞有明显的促凋亡作用。差异具有统计学意义;而且不同浓度5-FU作用于未经LPS刺激的巨噬细胞时，比受LPS激活的巨噬细胞表现出一定的抵抗力，其组内差异具有统计学意义。
3.Hoechst染色结果:染色结果可见LPS组细胞凋亡多于空白对照组，LPS+5-FU(0.5mM)组凋亡细胞明显多于LPS组，而相比于空白对照组，5-FU(0.5mM)组细胞凋亡未见明显增加。
4.Caspase-3活性变化:不同时间下不同浓度下呈不同的趋势，在6h组显示随5-FU的浓度增加而出现上升趋势;且6h组显示，与LPS组相比，5-FU可增加LPS刺激的巨噬细胞的凋亡，差异具有统计学意义。
5.Bcl-2、Bax及P53mRNA表达:受LPS诱导的巨噬细胞在不同浓度的5-FU作用24h下Bcl-2mRNA表达呈浓度依赖性降低趋势，而Bax mRNA及P53mRNA表达呈浓度依赖性升高，与LPS组相比，各组差异具有统计学意义。
6.Bcl-2、Bax、p-Caspase-3及P53/pP53蛋白表达:WB结果显示，6h组p-Caspase-3蛋白表达随浓度增加而增加，与LPS组相比，各组差异具有统计学意义。受LPS诱导的巨噬细胞在不同浓度的5-FU作用下Bcl-2蛋白表达呈浓度依赖性降低趋势，Bax、P53及pP53蛋白表达则呈浓度依赖性上升趋势，与LPS组相比，各组差异具有统计学意义。
结论:
1.成功建立实验需要的体外炎症实验模型。
2.5-FU能有效的诱导LPS激活的大鼠巨噬细胞凋亡，且呈现一定的浓度依赖性。
3.5-FU诱导巨噬细胞凋亡的机制可能与P53通路有关，通过影响Caspase-3、Bcl-2及Bax的表达而促进细胞凋亡。
5-氟尿嘧啶;脂多糖;巨噬细胞;蛋白表达
温州医科大学;温州医学院
硕士
外科学
周蒙滔
2013
中文
R730.263
41
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）