喹噁啉类遗传毒性分子机制
喹噁啉类化合物具有共同的喹噁啉-1，4-二氮氧基本结构，主要有卡巴氧(Carbadox，CBX)、喹乙醇(Olaquindox，OLA)、乙酰甲喹(Mequindox，MEQ)、喹烯酮(Quinocetone，QCT)和喹赛多(Cyadox，CYA)。该类化合物具有明显的抗菌促生长作用，被广泛用作饲料添加剂和生长促进剂。卡巴氧和喹乙醇因具有潜在的致畸、致癌以及致突变特性，被欧盟禁止用于畜禽饲料添加剂中。乙酰甲喹、喹烯酮为我国自主研制的新型喹噁啉药物，但有研究报道乙酰甲喹和喹烯酮能够损伤DNA。卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮和乙酰甲喹具有一定的遗传毒性效应，但是对于该类化合物遗传毒性分子机理并不清楚。研究普遍认为，该类化合物致DNA损伤是和自由基(ROS)密切相关，然而对于ROS的来源、种类以及ROS与DNA损伤的关系并不清楚。另外是否还存在有其它DNA损伤机理，也缺少相关研究资料。该类化合物遗传毒性共同点是能够引起哺乳动物细胞DNA发生断裂。本课题从ROS与DNA损伤、药物与DNA结合作用、拓扑异构酶(Topoisomerase，Topo)活性以及DNA复制与损伤修复酶基因表达四个角度入手，研究该类化合物致DNA损伤的分子机理。主要研究内容包括：
⑴筛选遗传毒性最强药物、最敏感细胞来确定研究材料:通过MTT法和彗星实验(SCGE)分别从细胞生长抑制和DNA断裂损伤两个方面来筛选敏感细胞和遗传毒性最强药物。结果显示，HepG2细胞对该类药物诱导下的生长抑制和DNA断裂损伤最为明显，喹烯酮致DNA断裂损伤作用最强。因此确定HepG2细胞和喹烯酮作为该类化合物遗传毒性分子机制研究材料。20μM喹烯酮可以显著增加HepG2细胞DNA断裂损伤。
⑵研究喹烯酮作用HepG2细胞所产生ROS的来源、种类以及与DNA损伤的关系:使用超氧阴离子自由基荧光探针检测ROS的种类，凝胶电泳法和线粒体DNA损伤检测来寻找ROS的来源。发现喹烯酮20μM以上均能够诱导细胞产生大量超氧阴离子自由基(O2·-)和羟基自由基(OH·)来损伤DNA，并且具有明显的时间和剂量依赖性效应关系;喹烯酮能够在黄嘌呤氧化酶(XOR)作用下代谢产生O2·-，这些ROS可以在体内转化成毒性更强的氢过氧自由基(HOO·)和OH·来损伤膜结构、酶系统以及核苷酸;SOD能够明显减轻喹烯酮诱导的DNA损伤;喹烯酮又可以引起线粒体DNA上细胞色素C氧化酶亚单位1(COX1)、细胞色素C氧化酶亚单位3(COX3)和ATP合成酶亚单位6(ATP6)基因发生突变，突变的基因造成更多ROS的产生。
⑶喹烯酮对拓扑异构酶的活性影响:琼脂糖凝胶电泳法检测喹烯酮作用HepG2细胞后的核提取物拓扑异构酶Ⅰ和拓扑异构酶Ⅱ活性，发现40μM喹烯酮能够抑制拓扑异构酶Ⅱ去连环反应的活性，而对拓扑异构酶Ⅰ没有影响。体外体系研究发现，喹烯酮也可以抑制拓扑异构酶Ⅱ断裂后的再连接作用，使HepG2细胞产生稳定的DNA-TopoⅡ断裂复合物，引起DNA的断裂。
⑷喹烯酮与DNA结合作用研究:采用紫外吸收光谱法和高效液相色谱法来研究喹烯酮与DNA的结合作用。结果发现40μM以上剂量的喹烯酮均能够和DNA发生非共价的沟槽或者静电结合，而不能发生共价结合。这种结合可能会阻止DNA复制过程中拓扑异构酶的移动，形成稳定的喹烯酮-DNA-TopoⅡ断裂复合物而造成DNA的断裂。
⑸荧光定量PCR法检测喹烯酮对DNA复制和修复关键酶基因表达的影响:发现30μM喹烯酮作用HepG2细胞后DNA损伤诱导因子(Gadd45)、细胞增殖抗原(PCNA)和拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)基因表达水平均受到明显影响。其中Gadd45基因表达倍数上调2倍以上。TopoⅡ和PCNA基因表达均下调，其中TopoⅡ基因在喹烯酮20μM剂量下作用2h表达就受到明显抑制，下调倍数在2倍以上。这种抑制效应能够被SOD减弱。
⑹喹噁啉类遗传毒性分子机理有以下几个方面：黄嘌呤氧化还原酶作为喹烯酮毒性作用的原发靶点，能够将其代谢产生超氧阴离子自由基和羟基自由基;代谢产生的ROS攻击胞浆中DNA合成原料鸟嘌呤、生物体膜系统以及抗氧化酶系统，使DNA合成原料供给障碍、脂质过氧化而产生DNA加合作用敏感物质MDA、改变膜的通透性、降低机体防御能力;穿过屏障系统的ROS更易攻击线粒体DNA和核DNA，造成DNA断裂、突变等多种毒性后果，这是该类化合物毒性作用主要机理。机体损伤严重情况下，喹烯酮更易透过屏障通过自由扩散作用进入核内和线粒体内与DNA发生作用，抑制拓扑异构酶活性，造成DNA断裂损伤，这是该类化合物毒性反应又一原发作用机理。线粒体DNA损伤后，继发产生更多ROS，持续性攻击生物大分子;核DNA损伤后，引起机体修复能力和抗氧化能力严重下降，最终产生更强的毒性损伤，这是继发性毒性作用结果。
兽用药物;喹噁啉制剂;遗传毒性;兽药药理
华中农业大学
硕士
基础兽医学
袁宗辉
2013
中文
S859.7
134
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）