脱二氧喹赛多、脱二氧乙酰甲喹抗体制备及酶联免疫吸附检测方法的建立
喹赛多和乙酰甲喹是人工合成的兽药，属于喹噁啉类药物，具有良好的抗菌及促生长作用，被广泛用于畜禽养殖业中。研究表明，喹赛多与同类药物相比毒性小、安全性较好，但其一些代谢产物多对动物存在潜在毒性，会引起食品安全问题。乙酰甲喹的毒性相对较大，长期使用或滥用会危害动物和人类的健康。因此，建立一种快速、灵敏的检测方法检测动物可食性组织中喹赛多和乙酰甲喹的残留情况有重大意义。本研究分别以脱二氧喹赛多和脱二氧乙酰甲喹为研究对象，旨在建立一种快速、灵敏、高通量的基于抗体的免疫学残留检测方法---酶联免疫吸附法(ELISA)。
脱二氧喹赛多(Cy4)是喹赛多的一种主要代谢产物，已被确定为其残留标志物。本论文根据脱二氧喹赛多的结构特征，通过羧甲基羟胺的肟化作用引入羧基，再采用混合酸酐法与载体蛋白(BSA、OVA)偶联，合成了免疫抗原Cy4-BSA和检测抗原Cy4-OVA。免疫雌性Balb/C小鼠后获得了效价高、灵敏度较高的多克隆抗体，取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤进行细胞融合，经三次细胞克隆和筛选，获得了3株能稳定分泌Cy4单克隆抗体的杂交瘤细胞株(A3C5、D9D2、F10D2)。制备了单克隆抗体腹水，并采用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水进行纯化。经检测，这三种杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的类型均为IgG2b，轻链为λ链，效价为1∶128000-1∶512000，且与其他结构类似物基本没有交叉反应，特异性较好。
本论文选用D9D2杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行ELISA检测方法的建立。通过优化各反应条件建立间接竞争ELISA(ic-ELISA)的标准曲线，该方法的灵敏度(IC50)为50 ng/mL，灵敏度比多克隆抗体提高了200倍，线性范围为(IC20-IC80)6.2-481.1 ng/mL。在鸡肉中添加脱二氧喹赛多的量在4-4000μg/kg时，其回收率为71.36％-83.10％，批内、批间变异系数均＜10％。本研究建立了一种基于单克隆抗体酶联免疫吸附检测方法，其灵敏度高、特异性好，可用于检测喹赛多在动物可食性组织中的残留。
脱二氧乙酰甲喹(M4)是乙酰甲喹的一种主要代谢产物，已被确定为其残留标志物。本论文根据脱二氧乙酰甲喹的结构特征，通过羧甲基羟胺的肟化作用引入羧基，再采用混合酸酐法与载体蛋白(BSA、OVA)偶联，合成了免疫抗原M4-BSA和检测抗原M4-OVA。免疫雌性Balb/C小鼠后获得了多克隆抗体。经检测其效价为1∶16000-1∶32000，效价较高;灵敏度(IC50)为0.32μg/mL-12.38μg/mL;与少部分结构类似物有交叉反应，特异性较好。选用灵敏度最高的多克隆抗体进行ELISA检测方法的建立，在猪肝脏在添加脱二氧乙酰甲喹的量在50-5000μg/kg时，其回收率为73.65％-85.82％，批内、批间变异系数均＜15％。本研究建立了一种基于多克隆抗体酶联免疫吸附检测方法，其灵敏度较高、特异性较好，可用于检测乙酰甲喹在动物可食性组织中的残留。
脱二氧喹赛多;单克隆抗体;间接竞争ELISA;酶联免疫吸附;免疫学残留
华中农业大学
硕士
微生物学
张吉斌
2013
中文
S859.84
84
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）