马铃薯薯形相关基因序列分析及光敏色素影响块茎形成初步研究
块茎是马铃薯的地下变态器官，由匍匐茎亚顶端细胞大量分裂后膨大产生。马铃薯块茎形态建成及其与块茎相关的性状是马铃薯产量和品质的重要组成部分，也是马铃薯块茎发育研究的主要内容之一。影响马铃薯块茎形成的因素较多，光周期、植物激素、温度以及离体培养条件下的培养基蔗糖浓度等均是重要调控因子，而关于块茎形状的调控因子目前还不清楚。本研究通过对一个长形薯插入突变体的侧翼序列信息分析，获得了一些控制块茎形状的相关基因序列，为研究块茎形状奠定了一定基础。通过基因表达分析和转基因等技术，初步分析了PHYA、PHYB、PHYB2、PHYE、PHYF等5个马铃薯光敏色素基因与马铃薯试管薯形成的关系，为明确光敏色素基因在块茎形成过程中的调控作用奠定了基础。其主要研究结果如下。
长形薯插入突变体的侧翼序列信息分析研究以本实验室前期在“鄂马铃薯3号”(E3)为受体的转基因系中获得的一个编号为pCL2b-2长形薯突变系为材料，在对表型的进一步鉴定的基础上，采用hiTAIL-PCR的技术扩增T-DNA插入位点两侧的侧翼序列，并对扩增序列进行了信息分析。结果显示，该突变体试管薯长宽比（1.78±0.15）显著长于野生型E3号试管薯长宽比（1.33±0.05）(p＜0.05);田间种植块茎长宽比为1.50±0.06，与野生型块茎（1.29±0.06）相比差异达到显著水平。T-DNA插入位点侧翼序列扩增获得了一个长度为965bp的序列，除去139bp的T-DNA上RB元件5'末端序列，实际扩增的马铃薯基因组序列826bp。在PGSC数据库中比对显示，该序列与异戊烯基转移酶基因(IPT)第4个内含子的822bp片段有89％的同源性，表明该突变体的T-DNA插入异戊烯基转移酶基因(IPT)内部。进一步分析显示，该突变体在插入位点为T-DNA片段替换了StIPT第4个内含子的317bp区段。信息分析表明，该基因是细胞分裂素合成调控的关键基因，本研究将其命名为StIPT,该基因插入突变改变了块茎形状，暗示StIPT基因可能参与马铃薯薯形发育。
与马铃薯试管薯形成相关的光敏色素关键基因研究马铃薯基因组数据库同源比对发现了5个光敏色素基因。其中PHYA和PHYB与前人报道一致，其他3个光敏色素基因根据它们与相关物种的光敏色素的序列同源性，分别将它们命名为PHYB2、PHYE和PHYF。为分析5种光敏色素对光周期的响应情况，E3试管苗在长日照条件下培养3周后分别转入长日照(16h/d)和短日照(8h/d)培养2天，期间每4小时取样以测定5种光敏色素表达水平。结果显示，5个光敏色素基因除PHYB外，其它4个都有一定的光周期节律，但对光周期的反应不尽一致。PHYA在短日照条件下的黑暗期有明显的表达峰，PHYB2在短日照12小时后呈现黑暗下表达上升，而光照下表达下降的趋势。PHYE和PHYF在两种光周期条件下表达模式一致，但PHYE表现出明显的光周期节律，光照的前4小时表达上升达到一个峰值，而后下降至黑暗下表达最低。而PHYF表现出时间节律，每24小时呈现两个峰值，没有光照和黑暗的区别。
为了研究5个光敏色素基因是否与马铃薯试管薯形成有关，实验构建了它们的RNAi干涉载体，采用农杆菌介导的转基因技术转化E3，共获得了151个转基因阳性株系。基因表达分析显示，干涉效率最高达98％，但也有部分株系完全没有干涉效果。5个基因的转基因干涉株系分别挑选不同干涉效果的3-5个株独立株系，在长短日照下培养60天，统计结薯率。结果显示，PHYB和PHYF干涉株系长日照条件下的结薯率比对照E3提高。结果表明PHYB和PHYF可能参与光周期调控马铃薯块茎形成的过程。分析干涉株系中块茎形成调控基因StCO和StSP6A的表达水平，发现StCO的表达水平未发现规律变化，但在长日照条件下，PHYB和PHYF的各干涉株系StSP6A的表达水平均较对照E3显著升高(p＜0.05)。上述结果初步证明，PHYB和PHYF可能通过对StSP6A的调控参与了马铃薯块茎的形成。PHYF为本研究首次证明其与块茎形成调控相关。
马铃薯;块茎发育;光敏色素;T-DNA插入
华中农业大学
硕士
遗传学
柳俊
2013
中文
S532
71
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）