吡咯喹啉醌高产菌的筛选、诱变、发酵及基因克隆
吡咯喹啉醌(PQQ)是一种新型的氧化还原型辅酶，具有许多生物功能，近几年来成为研究热点。本论文主要致力于吡咯喹啉醌产量方面的研究，分为以下四个章节。
1、本实验筛选获得一株高产吡咯喹啉醌菌株，经生理生化实验和16S rRNA鉴定属于假单胞菌属，命名为Pseudomonas sp.0813，简称:PS0813。用非酶检测法和高效液相色谱检测PS0813合成的PQQ能力，该菌种在未经过任何优化和基因工程改造下合成能力达到258mg/L。
2、由于其出色的产PQQ能力，对其进行发酵以得到更高产量。实验中，进行单因素实验及正交实验。对PS0813的培养基成分以及发酵条件进行研究。优化后依次对PS0813进行摇瓶发酵和发酵罐实验，发酵补料采用流加碳氮源和无机盐的方法，PQQ产量分别最高可达到448 mg/L和695 mg/L。这在未经任何诱变或基因工程改造条件下的天然菌株中，居于最高产量。
3、之后为了进一步提高产量对其进行诱变育种。本研究采用紫外-NaNO2复合诱变进行筛选，分别研究紫外的致死率和正突变率以及NaNO2致死率和正突变率，最终诱变剂量为紫外照射30 S之后与0.1M的NaNO2反应5min的条件下诱变效果最好，筛选出两株高产诱变株PM1和PM2，经传代培养2代确定其具有遗传稳定性。对PM1和PM2进行发酵，产量分别比原代菌产量提高1.63倍和1.56倍。
4、为了在基因水平上对PS0813菌株进一步研究，对该菌株的PQQ合成基因簇进行扩增，采用分段扩增。根据PqqD氨基酸序列的比对，设计出简并引物对PqqD片段进行扩增。结果得到约300bp长度的片段，经测序确定为PqqD基因。
吡咯喹啉醌;假单胞菌;生理生化;正交实验;基因克隆
北京化工大学
硕士
微生物与生化药学
田平芳
2013
中文
TQ464.8
88
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）